VIH EXPO

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CATEDRA DE VIROLOGIA
AÑO LECTIVO
2021 – 2022
DOCENTE
DRA. CARMEN MOSQUERA DE CHOEZ
 MICROBIÓLOGO – BIOLOGA MOELECULAR
MSC EN BIOTECNOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS
ESCUELA DE MEDICINA
SEGUNDO AÑO
VIH
FAMILIA SUBFAMILIA GÉNERO TIPO
Retroviridae Lentivirinae Lentivirus VIH-1 
VIH-2
MORFOLOGÍA
• Virión esférico
• 100 a 200nm de diámetro
• Nucleocápside en forma de cono
• 2 ARN
• 3 enzimas: Proteasa, Transcriptasa inversa e 
Integrasa
GENOMA DEL VIH
ESTADÍOS DE LA INFECCIÓN
CONDICIONES DEL LABORATORIO Y PRECAUCIONES 
CON LAS MUESTRAS
❖ Los laboratorios deben observar las normas de seguridad de nivel 2. 
❖ Todas las muestras deberán considerarse como potencialmente infecciosas 
❖ Trabajar con guantes en todos los procesos 
❖ Pipeteado mecánico
❖ Utilización de contenedores de seguridad biológica para los desechos. 
❖ Las superficies de trabajo deberán ser descontaminadas con desinfectantes como ciertos detergentes, 
incluido el jabón, alcohol-acetona al 70% v/v, lejía diluida, etc.
❖ Los sueros se deben recoger en la forma habitual y evitar mantenerlos más de 24 
horas a temperatura ambiente. 
❖ Usar tubos estériles y no conservarlos a +4ºC más allá de 72 h. 
❖ Para períodos de conservación más prolongados, hay que utilizar temperaturas de –20º 
y –70ºC, sobre todo si se prevé la necesidad de detectar el antígeno p24.
DIRECTOS: 
Demuestran la presencia de virus o de sus 
constituyentes (proteínas y ácidos nucleicos).
• Cultivo viral.
• Detección de ácidos nucleicos: PCR, 
bDNA, NASBA.
• Antigenemia (p24).
INDIRECTOS: 
Demuestran la respuesta inmunitaria (humoral o 
celular).
• Detección de anticuerpos específicos 
(pruebas serológicas):
• Pruebas de selección: ELISA, 
aglutinación.
• Pruebas de confirmación y 
suplementarias: WB, RIPA, IFI, LIA.
PRUEBAS LABORATORIALES
• Diagnóstico de la Infección del VIH
– Screening (tamizaje)
– Confirmatorio
• Pruebas complementarias para el seguimiento de 
paciente con la infección
– Recuento de de Linfocitos CD4/CD8
– Carga Viral
• Pruebas de Rutina
– Hemograma
– Orina
– Baciloscopia
– Parasitológico
– Otros
leucopenia
linfopenia
trombocitopenia
VSG elevada
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
POR EL VIH
MÉTODOS
• METODOS DIRECTOS
- Aislamiento viral:
Cultivo viral H9
- PCR : Detección de
fracciones antigénicas 
del virus ó genoma viral
• METODOS INDIRECTOS
- Detectan la presencia de
anticuerpos específicos contra 
el VIH por medio de técnicas 
serológicas.
* TEST RAPIDOS * IFI
* ELISA
* WESTERN BLOT * LIA
La técnica mas utilizada actualmente para el screening serológico es el 
test de ELISA y en menor proporción los Test Rápidos (OMS)
TAMIZAJE SEROLOGICO
ELISA
Negativo Positivo/Indeterminado 
Repetidamente
Correr una 
nueva muestra
Repetidamente 
POSITIVO
E
t
a
p
a
(1)
Correr una nueva muestra 
30 a 60 días después
Repetir etapas 1 y 2
WESTERN BLOT
Negativo Indeterminado Positivo
E
t 
a 
p 
a
(2)
PRUEBAS
RAPIDAS
Buena sensibilidad
Económicas y rápidas
Baja Especificidad
CULTIVOS
VIRALES
Buena especificidad
Lentas, baja sensibilidad 
Complicado. Costo
ELISA
Buena Sensibilidad 
y Especificidad
Sencillo y rápido
Periodo de Ventana 
Costo
WESTERN 
BLOT
Elevado Costo
Contaminación 
Especificidad 
Costo
Confirmatorio, alta 
Sensibilidad y Especificidad.
Seguro
Genotipificación 
Periodo de VentanaPCR
TEST VENTAJAS DESVENTAJAS
PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA
1) PREPARACIÓN DEL MOLDE
2) PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA
Para geles de 7 x 7 cm: 
Añadir 32 ml de Tampón de electroforesis 1 X 
más 0.30 gr de agarosa.
Agitar la mezcla para disolver los grumos de 
agarosa.
3) PREPARACIÓN DEL GEL PARA LA ELECTROFORESIS 
Sembrar 20 microlitros de cada muestra, utilizar 
para ello la micropipeta de volumen fijo que se 
suministra con una punta de pipeta
Se suministran 4 muestras diferentes presentadas en 
4 tubitos cada uno de un color, sembrar o cargar las 
muestras en el siguiente orden
4) SIEMBRA DEL GEL Y ELECTROFORESIS
Llevar a cabo la electroforesis
Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30 
minutos) o a 150 voltios (20 minutos).
PRUEBA RAPIDA PARA
VIH 
(INMUNOCROMATOGRAFIA)
PRUEBA RAPIDA PARA VIH
(INMUNOCROMATOGRAFIA)
• Objetivo
“ Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no
componentes virales
”
• Fundamento
- Método cualitativo indirecto basado en el 
principio de adsorción selectiva de 
inmunoglobulinas.
Prueba rápida para VIH
Prueba rápida para VIH
Prueba rápida para VIH
Prueba rápida para VIH
Prueba in Vitro
Tarjetas de ensayo recubiertas de antígeno 
recombinante del VIH 1 y VIH 2 y de 
péptidos sintéticos.
Laboratorios Abbott
ENZIMOINMUNOENSAYO
(ELISA)
TEST DE ENZIMOINMUNOENSAYO
(ELISA)
• Objetivo
Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no componentes virales
• Fundamento
- Método enzimático, cualitativo indirecto basado en el 
principio de “Sandwich” en un solo paso
FUNDAMENTO
Antígenos 
VIH1/2
Anticuerpos 
Suero o Plasma
Conjugado
Antígenos HIV1/2 
marcado con Enzima 
HPR
Sustrato 
(Sustrato Enzimático +
Cromógeno)
H2SO4
POSITIVO
Presencia de anticuerpos 
HIV 1/2 (color amarillo)
PLACA DE ELISA
NEGATIVO
Ausencia de Anticuerpos 
para VIH1/2
(Sin color)
L 
E 
C 
T
O
R D 
E
E
L 
I 
S 
A
Se lee a 450/630 nm
Lectura de la
reacción final
INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA
CALCULOS (Organón Teknika)
Validación del Test
* CN < 0.250 (Control Negativo)
* CP1 - CNx > 0.400 (Control Positivo)
* El CP2 - CNx > 0.400
* El Cutt Off = CNx + 0.100 = valor “x”
Valores mayores al Cutt Off, son Positivos 
Valores menores al Cutt Off, son Negativos 
Valores +/- 10% del Cutt Off, Indeterminados
WESTERN BLOT
(TEST CONFIRMATORIO)
TEST DE WESTERN BLOT
•Objetivo- Detectar anticuerpos específicos 
contra el VIH1/2
• Fundamento
•Test Inmunolineal o ELISA en banda, 
que detecta anticuerpos
•Lisado viral de células infectadas, 
sometidos a electroforésis en gel de 
poliacrilamida y transferido a hojas de 
nitrocelulosa
• POSITIVO
Criterios de 
interpretación
gp120 gp41 p31 p24 p17
- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relación 
al control ,
- Una banda de envoltura y la p24
- Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17 
para HIV1
- Proteínas gp105 y gp36 para HIV2
3+ 1+ +/-
Control
gp105 gp36
• INDETERMINADO
Criterios de interpretación
- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/-
- Si una banda presente intensidad <1+ y el
resto son negativos en relación al control
3+ 1+ +/-
Control Gp120 p24
• NEGATIVO
• Si todas las bandas presentan valoración <+/-
• Ausencia de proteínas
3+ 1+ +/-
Control
Criterios de positividad de la prueba WESTERN-BLOT
CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE A:
OMS Dos glucoproteínas cualquiera de: gp160, gp120, gp41
Cruz roja americana Una proteína de cada gen estructural (env, pol y gag)
FDAa p24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160)
CRSSa p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o p32 + (gp41 o gp120 o gp160)
CDC/ASTPHLDa p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160)
PRUEBAS 
COMPLEMENTARIAS 
PARA EL 
SEGUIMIENTO DE 
PACIENTES POSITIVOS
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
• Test para el seguimiento de pacientes
VIH Positivos
– Recuento de Linfocitos CD4/CD8
– Carga Viral
RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8
• Citometría de flujo
– Tamaño celular
– Complejidad interna o gránulos internos
– Intensidad relativa de la Fluorescencia
• ELISA (Enzimoinmunoensayo)
• Inmunofluorescencia (IFI)
CITOMETRO DE FLUJO
EPICS XL PECKMAN COULTER
Fundamento del Citómetro de Flujo
PARAMETROS DEL RECUENTO DE
CELULAS CD4/CD8
• El Recuento de CD4/CD8, tiene como 
finalidad de evaluar el estado 
inmunológico de la persona infectada
• Valores de referencia:
– Células CD4+ varían entre 600 a 1500 células 
por mm3 de sangre
– Células CD8+ varia entre 300 a 800 células 
por mm3 de sangre
– Relación de células CD4+ vs. CD8+es de 2:1
– Superiores a 500 celulas CD4+ (Buen estado de salud)
– Entre 200 y 500 celulas CD4+
• Incrementa riesgo de Herpes, Aftas, Infecciones en piel, Infecciones 
pulmonares, TB
• Enfermedades Oportunistas Pneumonia por Pneumocistis Carini, 
Citomegalovirus
– Entre 50 y 200 células CD4+
• Se incrementa el riesgo por PCP y otras enfermedades oportunistas
• Se recomienda ya el tratamiento preventivo
• Inferiores a 100, considerar el tratamiento preventivo para 
enfermedades oportunistas e infecciones masivas por hongos.
– Inferiores a 50 células CD4+
• Se incrementa riesgo de enfermedades oportunistas
• Continuar con terapias preventivas
VALORES ABSOLUTOS
CARGA VIRAL
DETECCIÓN DE RNA 
VIRAL
• AMPLICOR HIV MONITORTM Test
(Roche Diagnostic Systems)
• QuantiplexTM HIV RNA Assay
(Chiron Corporation)
• NASBA HIV-1 RNA QT
(Organon Teknika)
CARGA VIRAL
• La carga viral nos indica la actividad del virus
• Herramientas
CARGA VIRAL
– Niveles de RNA Viral
– Nivel de riesgo del desarrollo de la enfermedad
– Reacción a la terapia antirretroviral:
• Iniciar, modificar o incrementar medicamentos
– Si la droga o medicamento esta dando o no resultado y 
cuando empieza a perder su efectividad
• Muestra de sangre (plasma sanguíneo)
• Múltiples copias del virus presente en la 
muestra
• Proceso matemático se da el número estimado 
de las partículas virales presentes en la muestra
(200 –1.000.000 copias/ml)
• Margen de error del 20%
• Utilizar el mismo laboratorio y examen para el 
seguimiento y los cambios de la carga viral
CARGA VIRAL
• Los niveles altos de RNA Viral se 
correlacionan con bajos recuentos de 
Linfocitos CD4+
• Niveles superiores a 100.000 copias/ml 
propensas a desarrollar la enfermedad 
SIDA
• Niveles inferiores a 10.000 copias/ml 
disminuye el riesgo a la enfermedad
CARGA VIRAL
CARGA VIRAL
2000 ul1000 ul200 ulVolumen de 
plasma
240400200Nivel de 
detección mínimo 
(Sensibilidad 
copias/ml)
500-800.000400-10.000.000200-750.000Rango de
detección
QUANTIP 
LEX HIV-1 
RNA
NASBA HIV-1 RNA
QT Amplificación
isotérmica de RNA
(Roche) RT-
PCR
METODO AMPLICOR
DIAGNOSTICO
PEDIATRICO
• La presencia de IgG materna en el 
recién nacido dificulta el diagnóstico.
• Seguimiento durante 15 a 18 meses con 
WB en forma seriada.
• Detección de antígeno, aislamiento viral 
y la PCR son de utilida, pero debe ser 
evaluado con:
– Clínico
– Inmunológico
Factores que pueden influir 
en los resultados:
– Laboratorio
– Reactivos
– Tiempo de procesamiento
– Horario de la toma de muestra
– Presencia de infecciones
– Falta de sueño
– Estrés
– Otros factores biológicos
ANTIGENO p24
 Muestra de sangre venosa o por punción en el 
dedo.
 Antígeno p24: 
 Proteína vírica, niveles en sangre elevados al 
inicio de la infección por VIH, antes de que el 
organismo haya tenido tiempo de desarrollar 
anticuerpos. 
 Detecta el antígeno p24 y sirve como cribado de 
una infección reciente por el VIH.
RESULTADOS
 Positivo: Probable infección por VIH. Sin embargo, antes de establecer el 
diagnóstico, debe confirmarse con una segunda prueba.
 Negativo: Probablemente el individuo no se ha infectado por el VIH o 
quizás los niveles del antígeno p24 son demasiado bajos como para ser 
detectados (inferiores al límite de detección de la prueba). 
 Si persiste la sospecha de infección, lo recomendable es combinar esta 
prueba con otra de detección de anticuerpos frente a VIH.
• Para el diagnóstico de la Infección por el VIH
– PRUEBA RAPIDA, nos permite realizar el tamizaje 
serológico, mediante la detección de anticuerpos 
Anti -VIH1/2, con buena sensibilidad.
– ELISA, nos permite detectar los anticuerpos Anti- 
VIH1/2, con una alta sensibilidad y especificidad
– Es importante realizar el Test Confirmatorio de 
Western Blot, para dar un resultado final
CONCLUSIONES
• Para el seguimiento de pacientes con la 
infección, es importante:
– El Recuento de Linfocitos CD4/CD8, debe ir paralelo 
a la prueba Carga Viral
– Evaluar el estado clínico del paciente
• Realizar seguimiento al paciente VIH positivo, 
en coordinación de:
– Médico-Clínico,
– Laboratorio y
– Consejería
– Adherencia permanente
CONCLUSIONES
PREVENCIÓN
• Promoción a todo nivel social 
del uso del preservativo
• Tratamiento y prevención de 
otras enfermedades de 
transmisión sexual
• Programa de reparto de jeringas 
para drogadictos
BIOSEGURIDAD
TODO MATERIAL 
BIOLOGICO DEBE SER
CONSIDERADO Y 
MANIPULADO COMO 
POTENCIALMENTE 
INFECCIOSO
GRACIAS
	Diapositiva 1
	Diapositiva 2: VIH
	Diapositiva 3: MORFOLOGÍA
	Diapositiva 4
	Diapositiva 5
	Diapositiva 6: Estadíos de la infección
	Diapositiva 7: CONDICIONES DEL LABORATORIO Y PRECAUCIONES CON LAS MUESTRAS
	Diapositiva 8
	Diapositiva 9: MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
	Diapositiva 10: PRUEBAS LABORATORIALES
	Diapositiva 11: DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
	Diapositiva 12: MÉTODOS
	Diapositiva 13: TAMIZAJE SEROLOGICO
	Diapositiva 14: TEST
	Diapositiva 15
	Diapositiva 16
	Diapositiva 17
	Diapositiva 18: PRUEBA RAPIDA PARA
	Diapositiva 19: PRUEBA RAPIDA PARA VIH
	Diapositiva 20: Prueba rápida para VIH
	Diapositiva 21: Prueba rápida para VIH
	Diapositiva 22: Prueba rápida para VIH
	Diapositiva 23: Prueba rápida para VIH
	Diapositiva 24: Prueba in Vitro
	Diapositiva 25
	Diapositiva 26
	Diapositiva 27: ENZIMOINMUNOENSAYO
	Diapositiva 28: TEST DE ENZIMOINMUNOENSAYO
	Diapositiva 29: FUNDAMENTO
	Diapositiva 30: POSITIVO
	Diapositiva 31
	Diapositiva 32: INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA
	Diapositiva 33: WESTERN BLOT
	Diapositiva 34: TEST DE WESTERN BLOT
	Diapositiva 35: Criterios de interpretación
	Diapositiva 36
	Diapositiva 37
	Diapositiva 38
	Diapositiva 39: PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
	Diapositiva 40: RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8
	Diapositiva 41: CITOMETRO DE FLUJO
	Diapositiva 42: Fundamento del Citómetro de Flujo
	Diapositiva 43: PARAMETROS DEL RECUENTO DE
	Diapositiva 44: VALORES ABSOLUTOS
	Diapositiva 45: CARGA VIRAL
	Diapositiva 46: CARGA VIRAL
	Diapositiva 47: CARGA VIRAL
	Diapositiva 48: CARGA VIRAL
	Diapositiva 49: CARGA VIRAL
	Diapositiva 50: CARGA VIRAL
	Diapositiva 51: DIAGNOSTICO
	Diapositiva 52
	Diapositiva 53: Factores que pueden influir en los
	Diapositiva 54: ANTIGENO p24
	Diapositiva 55: RESULTADOS
	Diapositiva 56: CONCLUSIONES
	Diapositiva 57: CONCLUSIONES
	Diapositiva 58: PREVENCIÓN
	Diapositiva 59: BIOSEGURIDAD
	Diapositiva 60