TALLER GRUPAL

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ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA 
Mediante el microscopio 
electrónico es posible observar la 
morfología de las partículas virales 
presentes en muestras clínicas y se 
utiliza ampliamente en 
investigación, siendo restringida su 
aplicación al diagnóstico. Existen 
dos técnicas básicas: la microscopía 
de transmisión y la tinción 
negativa. 
Para el estudio de partículas virales en tejidos y células infectadas se emplea la 
microscopía electrónica de transmisión. Su poder de resolución permite observar 
estructuras moleculares como proteínas y ácidos nucleicos. Sin embargo, los haces de 
electrones que forman las imágenes de la muestra tienen escaso poder de penetración y 
no permiten la visualización directa de células aisladas ya que resulta demasiado gruesa. 
Esta técnica permite el estudio de las etapas de la replicación viral en las diferentes 
estructuras celulares y, asimismo, permite 
¿QUÉ ME DETECTA? 
Este método directo de diagnóstico virológico permite observar la morfología de las 
partículas virales, es decir, detecta la partícula viral como tal. 
PRINCIPIO – FUNDAMENTO 
❖ Su principio de funcionamiento se basa en utilizar electrones en lugar de luz para 
obtener una imagen de la muestra. Las partes principales del microscopio 
electrónico son: una fuente de electrones, un conjunto de lentes 
electromagnéticas, una cámara de vacío y una pantalla fluorescente. 
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA 
 
 
❖ El equipo (microscopio) tiene un cañón grande que emite electrones para que se 
difundan sobre la muestra, la cual estará sobre una grilla de carbón, ahí debe 
incidir el haz de electrones. Pero para que la muestra se pueda ver de blanco y 
negro, hay que agregarle a la muestra el ácido fosfotúngstico (en algunos casos 
el ácido uranílico) que tendrá acción de teñir negativamente las muestras. 
❖ En los viriones que no penetra la tinción se observan partículas blancas en fondo 
oscuro, esto se debe a la acción entre el ácido fosfotúngstico y el haz de electrones 
que cubre a la muestra. 
❖ Concentración de partículas virales es de al menos 10*4/ml 
PROCEDIMIENTO 
1. Colocación de un antisuero específico a una dilución adecuada. 
2. Rejilla sensibilizada. 
3. Aplicación de muestra con virus. 
4. Rejilla con partículas virales adheridas. 
5. Aplicación de contrastante. 
6. Rejilla contrastada lista para observar en el microscopio electrónico. 
IDENTIFICACIÓN DE RESULTADOS 
Aquí se observa la morfología de los 
viriones basándose en los 
conocimientos inculcados referentes a la 
forma y tamaño de cada virus. 
❖ Identificación rápida de viriones 
con morfología distintivas. 
❖ Observación directa de muestra 
clínica. 
❖ A veces en líquido de cultivo celular 
VENTAJAS 
❖ Mejora el diagnóstico virológico con un resultado más confiable. 
❖ La sensibilidad y rapidez son buenas 
 
 
❖ Resultado confiable. 
❖ Reconoce e identifica un virus en particular. 
DESVENTAJAS 
❖ Alto costo del equipo 
❖ Limitada diámetro de resolución (por qué no hay gran cantidad de muestra) 
❖ Persona experta para manejarla. 
Realizado por: 
 
 
 
ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA 
Las técnicas de enzimoinmunoensayo se pueden 
emplear tanto para detección de antígenos virales 
como de anticuerpos específicos (IgM, IgG o Igs 
totales). Son procedimientos de alta sensibilidad, 
similar a la del radioinmunoensayo (RIA) y para 
algunos virus (virus respiratorios), similar a la de 
la IF. 
La técnica de ELISA requiere, en términos 
generales, de tres componentes esenciales: el 
antígeno a detectar o cuantificar, un anticuerpo 
específico para ese antígeno conjugado a una 
enzima que genere una reacción cuantificable y 
un sistema que permita estimar la cantidad de antígeno presente en la muestra a partir de 
 (ENZIMOINMUNOANÁLISIS) ELISA DIRECTA 
 
 
la reacción enzimática que se genere. El resto de los detalles variará dependiendo del 
tipo de ELISA. 
¿QUÉ ME DETECTA? 
Detecta antígenos virales como anticuerpos específicos IgM, IgG, Igs totales. Se 
emplean para la detección de marcadores de HB (Hepatitis B), para antígenos del 
rotavirus, adenovirus, virus respiratorios, herpes simplex. El ELISA directo es adecuado 
para determinar la cantidad de antígenos de alto peso molecular y se considera el tipo de 
ELISA más simple 
PRINCIPIO – FUNDAMENTO 
Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante 
anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por 
ejemplo, un colorante, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene 
muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su 
realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, 
de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. 
PROCEDIMIENTO 
1. Preparación: Sacar el reactivo a temperar a 25 grados 
2. Disolver: En cada pocillo poner 100 microlitros de la muestra diluida (cada 
pocillo puede con 400 microlitros) 
3. Aquí después se agrega la enzima (TMB sustrato 100 microlitros) (ojo) 
4. Primera incubación: La muestra se incuba a 37 grados centígrados durante 1 
hora. 
5. La sacamos, se lava de 5 a 6 veces se le coloca el conjugado 
6. Incubamos por segunda vez por (1 hora más) y agregamos el sustrato 
7. Se deja 15 minutos (reacción del TMB, enzima y muestra) y se pone solución de 
Stop 
8. Leemos visualmente o por un espectrofotómetro 
 
 
IDENTIFICACIÓN DE RESULTADOS 
Los resultados finales de la lectura 
colorimétrica se reflejan numéricamente 
mediante valores de absorbancia o 
densidad óptica que se obtendrán a la 
longitud de onda más adecuada para la 
coloración final. 
El sustrato da el resultado + agua 
oxigenada + peróxido de rábano picante, 
hace que reaccione y se elimine un radical de agua + promogeno se oxida y da un 
producto coloreado. 
VENTAJAS 
❖ No se necesita de un observador experimentado 
DESVENTAJAS 
❖ Alto costos de equipos automatizados 
❖ Es un procedimiento complejo 
❖ Algunos sustratos pueden ser cancerígeno 
 Realizado por: 
 
 
 
 
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL 
QUE DETECTA: 
 INMUNOFLORESCENCIA DIRECTA 
 
 
La inmunofluorescencia directa (DIF) es una técnica utilizada en el laboratorio para 
diagnosticar enfermedades de la piel, los riñones y otros sistemas de órganos. También 
se le llama prueba fluorescente inmune directa o primario inmunofluorescencia. 
PRINCIPIO: 
Directo: marcador de fluoro foro se conjuga directamente con el anticuerpo primario que 
reaccionara con el epítopo diana. Necesitan contener grupos químicos capaces de formar 
enlaces covalentes con moléculas de proteínas, emitiendo una alta fluorescencia en el 
espectro visible con una coloración diferente a la emitida por los tejidos 
 PROCEDIMIENTO: 
Se toma la muestra clínica, por ejemplo, un frotis faríngeo y este tendrá el antígeno del 
microorganismo en estudio. Este frotis es puesto en contacto con un anticuerpo 
monoclonal específico del antígeno y esta conjugado con isotiocianato de fluorescencia. 
Únicamente los microorganismos que tienen el antígeno en estudio reaccionarían y se 
creara un complejo antígeno-anticuerpo. 
 
❖ Grupo funcional de la molécula fluorescente que absorberá energía (FOTONES) 
de una longitud de onda especifica elevándola a un estado muy corto de 
excitación, permanece en estado de excitación por un periodo de tiempo muy 
corto. El retorno a nivel de energía es acompañado por emisión de luz. 
(fluorescencia) este fenómeno luminoso visible tiene una longitud de onda 
diferente mayor longitud de onda (es decir con menor energía). 
✓ Al atravesar la energía el compuesto hace que se desubiquen los 
autónomos que lo forman y giran en sus orbitas alrededor del núcleo. 
❖ Longitud de onda es absorbida porla sustancia fluorescente emiten está a una 
longitud que lo forman diferente. 
 
 
✓ Fluoro foro: Parte del fluorocromo responsable de la emisión de la 
fluorescencia 
✓ Fluorocromo: Marcador para un determinado anticuerpo, molécula capaz 
de absorber fotones y emitir de menor energía (mayor longitud de onda). 
❖ La cantidad de energía emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio 
fluorocromo como de su ambiente químico. 
INTERPRETACION DE RESULTADOS 
Positivo: La fluorescencia está presente en los tejidos al conjugarse con el antígeno 
especifico 
Negativo: La inmunofluorescencia está ausente 
 Considerar que hay factores que intervienen o afectan los resultados de la prueba, 
incluyendo el tipo de reactivo, fijador, tiempo y concentraciones, especie de los 
anticuerpos, uy colores emitidos por el fluorocromo, siendo los colores del espectro 
medio como la verde manzana co0n utilización más frecuente en la prueba, vista desde el 
microscopio de fluorescencia en luz ultravioleta. 
VENTAJAS: 
❖ La IF es una técnica rápida y especifica 
que se puede hacer en un corto espacio de 
tiempo ya solo requiere un solo paso de 
etiquetado. En comparación con la 
indirecta que necesita usar un anticuerpo 
secundario conjugado para detectar el 
anticuerpo primario (más pasos 
adicionales). 
❖ Generalmente es más sensible al cultivo celular. 
❖ Se pueden identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. 
❖ Evita la reactividad cruzada entre anticuerpos secundarios, en la directa el 
fluorocromo ya está conjugado con el anticuerpo primario mientras que en la 
indirecta los secundarios pueden reaccionar de forma cruzada con especies 
distintas a la diana. 
 
 
 
DESVENTAJAS: 
❖ Baja sensibilidad en comparación con otras técnicas (IFI/PCR) la indirecta ofrece 
una mayor sensibilidad porque más de un anticuerpo secundario puede unirse a 
cada anticuerpo primario, lo que resulta una amplificación de la señal. 
❖ Menor flexibilidad, en el caso de la secundaria puede utilizar varios anticuerpos 
secundarios mientras que en la directa los anticuerpos primarios preconjugados 
disponibles limitan su flexibilidad. El flujo del trabajo puede ser menos flexible 
(puede haber menos colores disponibles), más caro y si los conjugados directos 
etiquetados comercialmente no están disponibles, más difícil. 
❖ La señal del fluorocromo en el número finito del fluoro foros que se puede unir 
a un solo anticuerpo y por tanto se limita la detección a objetivo de alta 
abundancia. 
Realizado por: 
 
 
 
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL 
QUE DETECTA: 
La posibilidad de determinar en un huésped la 
presencia de anticuerpos específicos contra 
antígenos específicos, y por tanto establecer un 
diagnóstico indirecto y seguir el curso de tales 
anticuerpos ha sido estudiada con distintos 
sistemas. En el estudio y evaluación de las 
enfermedades del tejido conectivo (Lupus 
Eritematoso Sistémico. Artritis Reumatoidea, 
Escleroderma, Enfermedades Conectivas Mixtas], el estudio de los anticuerpos 
 INMUNOPEROXIDASA 
 
 
antinucleares por inmunofluorescencia es sin duda la prueba más sensible y mejor 
estandarizada. 
 PRINCIPIO: 
 La posibilidad de determinar en un huésped la presencia de anticuerpos específicos 
contra antígenos específicos, y por tanto establecer un diagnóstico indirecto 
 
PROCEDIMIENTO: 
❖ Se utilizó la técnica descrita por Sternberg modificada por Holubar y Wolff. Los 
cortes de hígado de rata Wistar de un mes de dad. Fueron obtenidos por crióstato; 
se utilizaron cortes de tres micras los cuales se montaron en láminas portaobjetos 
específicamente diseñados para el caso y se utilizaron frescos y sin fijar. 
❖ Los sueros se procesaron haciendo hasta 10 diluciones seriadas, al doble, a partir 
de 1:10 usando como diluyente solución salina buffer pH 7.2. Los controles 
consistieron en suero reactivo conocido, un suero negativo y un control de 
coloración en el que. en vez de suero, se utilizó solución salina. 
❖ Las láminas con los cortes fueron coloca das en un soporte de madera y después 
de mantenerlas al ambiente, por 30 minutos se cubrió cada corte con suero normal 
de cabra, que, de acuerdo con lo recomendado por varios autores (3, 4, 5) evita 
reacciones de especificidad. Cada preparación fue cubierta luego con la 
respectiva dilución, tanto de los sueros problema como de los controles; luego de 
una incubación en cámara húmeda por treinta minutos a temperatura ambiente, 
se retiró el exceso de suero dejándolo caer libremente sobre servilletas de papel 
y se lavaron las láminas, colocadas cuidadosamente en un soporte, en solución 
salina buffer pH 7.2 por diez minutos. Enseguida se cubrieron las preparaciones, 
nuevamente colocadas en el soporte de madera, con un antisuero anti-IgG 
humana obtenido en cabra y previamente titulado para contener 8 U. 
precipitantes por ml., y se cumplió el proceso de incubación y lavado en forma 
idéntica al paso anterior. 
❖ En el paso siguiente las preparaciones fueron tratadas con un suero anti-cabra no 
diluido. Obtenido en conejo y sometidas al procedimiento de los anteriores pasos. 
Luego se trataron las preparaciones con un suero anti-peroxidasa obtenido en 
cabra; se utilizó una dilución 1:8. 
 
 
❖ En el paso final se cubrieron las preparaciones con peroxidasa en una 
concentración de 25 mg/ml. Luego de la incubación adecuada y subsiguiente 
lavado se procedió a fijar las preparaciones en una solución de glutaraldehído 
1.25% por un tiempo crítico de 15 minutos, transcurridos los cuales, se lavaron 
cuidadosamente con solución salina tamponada. buffer por diez minutos 
❖ Para revelar la reacción de la peroxidasa se utilizó el procedimiento de Graham 
y Karnovsky usando el revelador preparado minutos antes Este reactivo se colocó 
cuidadosamente sobre cada uno de los cortes y se dejó actuar por un máximo de 
15 minutos, al término de los cuales se lavó con buffer de Tris-HC1. 0.5 M pH 
7.6 por diez minutos. Luego se montaron las preparaciones con líquido de 
montaje consistente en una mezcla de nueve partes de solución salina buffer y 
una parte de glicerol y se cubrieron con laminillas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 
De los setenta sueros estudiados que 
llenaron los requisitos de calidad 
exigidos. Siete presentaron 
inequívocamente pruebas positivas a 
título de 1:160 a 1:640; siete tuvieron 
reacción positiva, tres en dilución 120 y 
cuatro en dilución 1:40. Estas fueron 
consideradas como negativas, debido a 
que las reacciones se tomaron como 
falsas positivas toda vez que la prueba 
 
 
 
se hizo negativa en las diluciones subsiguientes; cincuenta y cuatro sueros fueron 
francamente negativo. Al confrontar los resultados obtenidos en esta prueba con los 
obtenidos por quienes practicaron inmunofluorescencia. Se pudo apreciar la 
concordancia entre ambos procedimientos tanto para los casos francamente negativos, 
como para los positivos. Esta concordancia fue tanto cualitativa como cuantitativa. Los 
casos falsos positivos. Pero fácilmente dilucidados como negativos. En la prueba de 
peroxidasa, fueron negativos a la inmunofluorescencia. 
VENTAJAS: 
❖ Permite una localización más precisa de las reacciones ya que la tinción es 
permanentemente estable. 
❖ Puede concentrase y puede ser evaluada con microscopio de luz. 
❖ El material estudiado puede archivarse por años sin pérdida de intensidad de la 
reacción. 
❖ Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad 
sensibilidad y gama de esta técnica. 
DESVENTAJAS: 
❖ Presencia de reacción inespecífica especialmente cuando se utilizan anticuerpos 
policlonales. 
❖ Requieren estandarización precisos y estricto control de calidad. 
❖ Algunos reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser 
cuidada. 
Realizadopor: 
 
 
 
 
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ 
 CONVERSIÓN SEROLÓGICA 
 
 
DETECTA 
Se aplica para demostrar el contacto con un 
determinado agente infeccioso causante 
potencial de enfermedad. También para verificar 
la protección obtenida mediante una vacuna, si 
tras la administración de una vacuna se logra una 
seroconversión del 99%, ello significa que el 
99% de las personas vacunadas han adquirido 
inmunidad frente al agente infeccioso y por tanto 
están protegidas contra esta enfermedad concreta. 
PRINCIPIO 
Es la aparición de anticuerpos contra una determinada enfermedad infecciosa. Para 
demostrarla es preciso analizar al menos dos sueros de la misma persona separados por 
un intervalo de tiempo variable, por ejemplo 2 semanas. En general se considera 
seroconversión al aumento al menos de cuatro veces en el título de anticuerpos en el suero 
frente a un antígeno concreto, con relación al obtenido 2 o 3 semanas antes. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
La seroconversión como procedimiento diagnóstico tiene sus limitaciones, derivadas de 
la necesidad de obtener dos sueros del mismo paciente separados en el tiempo, lo cual a 
veces no es posible, por otra parte, la elevación del nivel de anticuerpos puede demorarse 
hasta 2 meses tras el inicio de los síntomas y existen casos de falsos negativos, en los 
que, a pesar de la negatividad de las pruebas serológicas, se puede detectar la presencia 
del agente patógeno mediante cultivo u otros métodos. 
VENTAJAS 
❖ La seroconversión puede ser de gran importancia legal en determinadas 
circunstancias, por ejemplo, para demostrar que se ha producido infección por un 
agente infeccioso tras un pinchazo accidental con material infectado en un 
laboratorio clínico. 
https://es.wikipedia.org/wiki/Vacuna
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunidad
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunidad
 
 
DESVENTAJAS 
❖ La seroconversión suele indicar infección activa, pero con frecuencia se observa 
tardíamente. 
Realizado por: 
 
 
 
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ 
DETECTA 
Western Blot es una técnica utilizada para detectar una proteína específica en una 
muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar 
las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie 
de una membrana. 
PRINCIPIO 
Es un principio de proceso de tres pasos con electroforesis en gel, seguido de borrar y 
sondeo con los anticuerpos de la membrana. Detección de proteína puede ser directa o 
indirecta, con el último usando un anticuerpo secundario marcado contra el principal. 
PROCEDIMIENTO 
❖ Preparación de la muestra. 
❖ Electroforesis en gel. 
❖ Transferencia a una membrana 
❖ Inmunotinción 
❖ Detección de las bandas 
 WESTERN BLOT 
 
 
1. Añadir 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo. 
2. Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo las TIRAS DE 
NITROCELULOSA necesarias y coloque cada tira en su pocillo con el numero hacia 
arriba. 
3. Incube las tiras durante 1 o 2 min a temperatura ambiente en un plato basculante. 
Extraer el tampón por aspiración. 
4. Añada 2ml de TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo. 
5. Añada 20 microlitros de suero de pacientes en cada uno de los pocillos. 
6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura 
ambiente en el plato basculante. 
7. Aspirar la mezcla de los pocillos. Evitar contaminaciones. 
8. Lave tres veces cada tira con 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO, dejando 
que se empapen durante 5min en la plataforma basculante. 
9. Añada 2ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo. 10. 
Cubrir la bandeja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en la plataforma 
basculante. 
10. Aspire el Conjugado de los pocillos y lavar tres veces. 
11. Añadir 2ml de SUSTRATO a cada pocillo. 
12. Cubra la bandeja e incube durante 15min en la plataforma basculante. 
13. Aspire el sustrato y lavar tres veces. 
14. Utilizando pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel, cúbralas y 
séquelas con cuidado. 
15. Coloque las tiras en una hoja de trabajo y Observe las bandas calificando los 
resultados. 
 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
 
 
El resultado de la prueba de Western Blot se informa como negativo cuando hay ausencia 
total de bandas; como indeterminado, cuando no cumple los criterios definidos en la tabla 
1 y no es negativo, y positivo cuando cumple los criterios, de acuerdo con el que se haya 
adoptado. 
VENTAJAS 
❖ Las membranas húmedas son flexibles y fáciles de manipular. 
❖ Las proteínas bloqueadas en la membrana son accesibles para los diferentes 
ligandos. 
❖ Se necesitan pocos reactivos para el análisis. 
❖ Se pueden mantener las membranas útiles durante más tiempo. 
DESVENTAJAS 
❖ Resultados propensos a falsas o subjetiva: A pesar de su sensibilidad y 
especificidad, una mancha blanca /negra occidental todavía puede producir 
resultados erróneos. Un falso positivo se produce cuando un anticuerpo reacciona 
con una proteína no-pensada, que es lo que ocurre con frecuencia cuando un 
paciente sometido a prueba para el VIH pasa a tener tuberculosis o un número de 
infecciones parasitarias. 
❖ Alto costo y demanda de técnica: El costo de un western Blot es un compuesto 
de los grandes gastos individuales para etiquetado anticuerpos, analistas 
calificados y equipo de laboratorio. Un proceso delicado, el borrar occidental 
requiere precisión en cada paso para la correcta identificación de los 
componentes de la muestra. Un error leve en la concentración de reactivo o en 
periodo de incubación puede ser desastroso para todo el proceso. 
Realizado por: 
 
 
 ELISA INDIRECTA 
 
 
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ 
PRINCIPIO DE LA PRUEBA 
La prueba se basa en una placa de micro titulación de poliestireno con 96 pocillos, 
en el fondo de cada pocillo se encuentra un anticuerpo especifico, en la que se agrega 
la muestra diluida que contiene el virus, luego se le agrega la enzima peroxidasa y el 
sustrato TMB (Tetrametil Benceno) que es aquel que dará la reacción química o 
colorimétrica del antígeno 
¿QUÉ DETECTA? 
❖ Detección de antígenos virales, anticuerpos específicos: IgG, IgM (especifica 
de HA, citomegalovirus, herpes simplex). Igs totales (HIV Y HTLV) en una 
muestra. 
❖ Detección de marcadores de HB, antígenos del adenovirus, herpes simplex. 
rotavirus, virus respiratorios. 
 PREPARACION DE LA MUESTRA 
 
 
 
 
 
 
 
Debemos seguir el Protocolo de trabajo que nos ayuda identificar a la persona que le 
estamos realizando el examen, además que se debe dejar 6 pocillos para el control, 
también debemos temperar los reactivos a temperatura de 25 C. por 30 min. 
DISOLUCIÓN DE LA MUESTRA 
 
 
1. Se realiza una dilución con el diluyente de muestra. Se pone 100 microlitros 
en el pocillo, luego de esto así mismo con la muestra del paciente le vamos a 
agregar 100 microlitros en lo que es el pocillo. 
2. 1 ERA INCUBACION a 37 C 1h. Se incuba la muestra con el diluyente de 
la muestra y es donde ocurre la unión antígeno anticuerpo al fondo del 
pocillo. 
3. Se realiza de 5 a 6 lavados con el tampón de lavado de muestra. Para descartar 
los antígenos que no se han unido. 
4. AGREGAR ENZIMA PEROXIDASA. Se hace el conjugado agregando el 
anticuerpo con la enzima peroxidasa se le agrega 100 microlitros al complejo 
antígeno anticuerpo ya formado anteriormente 
5. Se realiza de 5 a 6 lavados para quitar el conjugado que no se ha podido unir 
6. SE AÑADE TMB SUSTRATO (tetrametil benceno) 100 microlitros para dar 
la coloración al resultado 
7. Se realiza la incubación de 15 min a temperatura ambiente. 
8. Se añade una solución de stop para que se detenga la reacción 
LECTURA DE RESULTADOS: 
❖ Positiva: cambiode color hacia amarillo o naranja. 
❖ Negativa: Queda azul (por sustrato de TMB solución de 
tetrametilbencidina). 
Observamos densidad óptica va hasta 3000 o ponemos en espectrofotómetro y nos 
da medida. Va de 0 a 3000 
❖ Positivo fuerte 3000 
❖ Positivo débil 1500 a 2000 
❖ Inespecífico en Elisa de 200 a 300 
❖ Negativo 0 
 VENTAJAS 
❖ Es una técnica sensible 
❖ Fácil 
❖ Buena 
 
 
❖ Especifica 
❖ Rápida 
DESVENTAJAS 
❖ Necesario elegir materiales de plásticos adecuados como soporte y que algunos 
sustratos como la ortofenilendiamina pueden ser cancerígenos. 
❖ Alto costo de los equipos automatizados 
 
 
 
 
 
 
 
Realizado por: 
 
 
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ 
PRINCIPIO Pone en evidencia la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en 
el suero del paciente sobre cepas virales. 
UTILIDAD De gran valor en estudios epidemiológicos, determina la presencia de 
anticuerpos protectores inducidos mediante vacunas 
PROCEDIMIENTO: 
1. Recuperar el virus del medio de cultivo y/o de las células 
2. Mezclar alícuotas del virus con anticuerpo específicos antivirus: polio (1, 2 y 3), 
antivirus ECHO y antivirus Coxsackie; e incubar 1 hora a 37°C 
3. Inocular en nuevos cultivos celulares. 
 NEUTRALIZACIÓN 
 
 
4. Si el virus aislado es polio, será neutralizado por el suero antipolio polivalente y los 
cultivos infectados con esa mezcla no desarrollarán ACP. Por el contrario, los 
cultivos inoculados con las mezclas: Virus + suero anti ECHO, y con virus + suero 
anti-Coxsackie desarrollarán ACP. 
5. Inocular alícuotas del virus con sueros de los antivirus específicos e incubar 1h a 
37c 
6. Inocular nuevos cultivos con cada una de las 3 mezclas 
7. Observar la aparición de APC 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VENTAJAS 
❖ De gran valor en estudios epidemiológicos 
❖ Determinar la presencia de anticuerpos protectores inducidos mediante vacunas 
 
DESVENTAJAS 
❖ Proceso complejo 
 
 
❖ Suele abarcar hasta 4 semanas 
❖ Costoso 
Realizado por: 
 
 
 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES 
OBJETIVO Buscar la presencia de un determinado antígeno (antígeno problema). 
DETECTA Permite la detección de anticuerpos específicos virales en el suero del paciente 
por medio un fluorocromo (isotiocianato de fluoresceína). 
PRINCIPIO 
El principio está basado en una lámina portaobjeto con pocillos circunscritos en el cual 
se pone la muestra del paciente (ac no conjugado), se lava, se lo deja media hora, se 
coloca el conjugado (fluoresceína), se lava cuatro veces, y se lee los resultados. 
PROCEDIMIENTO 
1. Preparación: Muestra cortada por criostato 
en portaobjetos, fijada con acetona fría. 
10min. 
2. Incubación con antisueros específicos (37 °c 
a 30min) 
3. Lavado: Elimina anticuerpos no fijados. 
Lavar 
4. Agregado: Anticuerpo conjugado con 
fluoresceína (Igs) 
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA 
 
 
 
5. Incubación por media hora más. Lavar. 
INTERPRETACIÓN 
❖ Positivo a HTLV-1: Pocillo superior 
(muestra): Verde manzana, la célula en 
forma tubular como sellos de anillo. 
Pocillo inferior (célula sin virus): No 
hay reacción. 
❖ Negativo a HTLV-1: No hay reacción 
entre el anticuerpo y el antígeno viral. 
VENTAJAS 
❖ Permite diagnosticas en pocas horas. 
❖ Elevada sensibilidad 70%. 
❖ Con 2-3 células se puede realizar el diagnóstico. 
DESVENTAJAS: 
❖ Alto costo de microscopio de IF. 
❖ Dificultad para interpretar si no hay una persona entrenada. 
 Realizado por: 
 
 
 
 
 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES 
 PCR (REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA) 
 
 
OBJETIVO Conseguir una enorme amplificación del número de moléculas que contienen 
la secuencia diana o de interés. 
DETECTA Se utiliza para detectar RNA. 
PRINCIPIO 
❖ Desnaturalización. 
❖ Templado (hibridación). 
❖ Elongación (replicación). 
PROCEDIMIENTO 
1. Desnaturalización a 94-
96°C 
2. Alineamiento a 68 °C 
3. Extensión a 72°C 
INTERPRETACIÓN 
PCR IgM IgG Interpretación 
- - - Negativo 
+ - - Fase inicial de la infección 
+ + - Infección confirmada 
+ + + Fase activa de infección 
+ - + Fase final de la infección 
- + - Estudio temprano con falso negativo. 
- - + Infección pasada. Fase de recuperación 
- + + Fase final de la infección 
 
DETECCIÓN Y AMPLIFICACIÓN 
PCR se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión 
de determinados genes (su traducción a proteínas). 
 
 
1. Se extrae el ARNtotal de las células en estudio y se separa la fracción 
correspondiente al mensajero (ARNm). 
2. Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, 
por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria 
que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN 
polimerasa. 
3. Se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de 
ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. 
La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante 
secuenciación automática de ADN. 
VENTAJAS: 
❖ Alta sensibilidad 
❖ Alta especificidad 
❖ Rapidez 
DESVENTAJAS: 
❖ Contaminación. 
❖ La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN. 
 
 
 
 
 
 
 
Realizado por: 
 
 
 
 
 
 
ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA 
QUE ME DETECTA 
❖ Utilizando PCR hibridación 
in situ podemos detectar una 
única copia de genoma del 
virus del papiloma humano 
(HPV) en una célula 
determinada. Esto permite 
localizar células que contienen 
el virus en infecciones ocultas 
94. 
❖ Mutación puntual de un gen: RED, SB, PCR, AS... 
❖ Creación de un nuevo gen: NB, PCR; leucemia ... 
❖ Reordenamiento de un gen: SB, PCR 
❖ Traslocación de un gen: SB, PCR, FISH 
PRINCIPIO 
Diseñada para aumentar la especificidad. Esta modificación consta de dos grupos de 
cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla 
de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente 
o anidados con respecto al primer grupo. 
PROCEDIMIENTO 
Seguidamente, el producto de este primera PCR se utiliza como molde para una segunda 
ronda, la cual utiliza cebadores internos a la región previamente amplificada. La 
sensibilidad de la PCR anidada es extremadamente alta debido al proceso de 
amplificación dual. 
 
 PCR ANIDADA O NESTED PCR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta técnica es la contaminación, 
por lo que su utilización es difícil en laboratorios de rutina. En el estudio de los genes 
IgH, el ADN genómico puede ser amplificado utilizando oligonucleótidos específicos 
para la región variable (FR2A) y de unión (LJH). La secuencia obtenida es comparada 
con la secuencia VH de línea germinal utilizando programas informáticos como 
HUSAR84. 
VENTAJAS 
❖ Mejor sensibilidad y 
especificidad 
DESVENTAJA 
❖ Mayor contaminación y 
tiempo prolongado 
 Realizado por: 
 
 
 
 
 
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL 
QUE ME DETECTA 
La RT-PCR es un 
método de base nuclear 
que detecta la presencia 
de material genético 
específico de los 
patógenos, como los virus. 
Los ensayos moleculares, como la técnica RT-PCR, están diseñados para identificar con 
precisión el ARN viral de la influenza A y B o los ácidos nucleicos utilizando genes 
conservados. 
PRINCIPIO 
La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es una variante de la PCR convencional 
donde se utiliza ácido ribonucleico (ARN) como molde para sintetizar ADN 
complementario (ADNc), con el que posteriormente se realiza la PCR correspondiente. 
PROCEDIMIENTO 
La reacción se lleva a cabo 
mediante la repetición sucesiva de 
un ciclo de tres pasos,cada uno a 
temperatura diferente. En cada 
paso o cambio de temperatura 
ocurre un proceso que en su 
conjunto complementan la PCR. 
Primeramente, la 
desnaturalización del ADN o 
separación de la doble cadena, luego la unión de los oligonucleótidos o cebadores a las 
 RT PCR 
 
 
cadenas simples de ADN y, por último, la extensión o polimerización donde la ADN 
polimerasa cataliza la formación de doble cadena de ADN. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
A partir de los productos de ADNc, podemos examinar la composición genética de 
diferentes tumores, realizar la PCR de manera tradicional y cuantitativa, expresar 
proteínas únicas, generar bibliotecas de secuencias de ADN que codifican proteínas 
importantes y mucho más. 
VENTAJAS 
❖ Dan resultados consistentes, el protocolo es simple y rápido y hay menos pipeteo. 
DESVENTAJA 
❖ Esta técnica es menos sensible y no es posible optimizar las reacciones 
individualmente. 
❖ El proceso tampoco proporciona un stock para ADNc. 
Realizado por: 
 
 
 
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ 
QUE ME DETECTA 
La RT-PCR en tiempo real es 
un método de base nuclear que 
detecta la presencia de material 
genético específico de los 
patógenos, como los virus. 
 REAL TIME PCR 
http://humangenes.org/cdna-complementary-dna
http://humangenes.org/cdna-complementary-dna
 
 
PRINCIPIO 
Puedo utilizarte tanto en forma cualitativa como cuantitativa. la PCR en tiempo real 
genéticas, por lo general, utilizan más de un par de primers y varias sondas marcadas a 
fin de detectar todos los serotipos de adenovirus. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
Resultado negativo 
❖ Un resultado negativo significa que no hay evidencia de ARN viral de la 
influenza o ácidos nucleicos en el espécimen respiratorio sometido a prueba. Para 
los pacientes hospitalizados, en especial para los pacientes con enfermedad en 
las vías respiratorias inferiores, si no se identifica ninguna otra etiología y todavía 
se sospecha clínicamente la presencia de influenza, se deben recolectar y 
examinar más muestras y se debe iniciar o continuar el tratamiento antiviral. 
Resultado positivo 
❖ Un resultado positivo indica la detección de ARN viral de influenza o ácidos 
nucleicos en el espécimen respiratorio sometido a prueba, que confirma la 
infección por el virus de la influenza, pero no necesariamente significa que el 
virus infeccioso está presente o que el paciente puede contagiar. 
❖ Un resultado positivo en las pruebas de detección en especímenes de las vías 
respiratorias superiores en una persona que recibió por vía intranasal la vacuna 
atenuada en virus vivos (LAIV) contra el virus de la influenza puede indicar la 
detección de los virus contenidos en la vacuna. La LAIV contiene cepas del virus 
de la influenza que replican el virus en tejidos respiratorios de menor temperatura 
(por ejemplo, fosas nasales) que la temperatura corporal interna. Debido a que 
las fosas nasales se infectan con las cepas vivas del virus de la influenza de la 
vacuna durante la administración de LAIV, las muestras de las fosas nasales 
extraídas unos días después de la vacunación con LAIV pueden causar resultados 
positivos de influenza. Puede ser posible detectar cepas de la vacuna LAIV hasta 
7 días después de la vacunación y, en casos menos frecuentes, por periodos 
mayores. 
 
 
❖ La interpretación de los ensayos moleculares de influenza dependerá de la prueba 
individual que se realice. Por ejemplo, un resultado negativo de un ensayo 
molecular de influenza que solo detecta el virus de la influenza A y el subtipo 
A(H1N1) pdm09 no descarta infección por el virus de la influenza B. Los 
médicos pueden consultar el prospecto del producto para conocer las 
descripciones detalladas de cada prueba autorizada por la FDA y qué puede o no 
puede significar el resultado. 
VENTAJAS 
❖ Los ensayos moleculares de detección rápida y algunas pruebas moleculares 
disponibles comercialmente permiten obtener resultados en un periodo razonable 
como para emplearlos en las decisiones de manejo clínico (aproximadamente de 
15-30 minutos a menos de 1.5 horas). 
❖ Los ensayos moleculares son más sensibles y específicos para detectar los virus 
de la influenza que otras pruebas de influenza (p. ej., pruebas de diagnóstico 
rápido de la influenza, inmunofluorescencia y cultivo viral). 
❖ Las probabilidades de un resultado falso positivo o falso negativo son bajas y, 
por consiguiente, la interpretación del resultado se ve menos afectada por el nivel 
de actividad de la influenza en la comunidad 
❖ Algunos ensayos moleculares, pero no todos, pueden distinguir entre subtipos 
específicos del virus de la influenza A. 
DESVENTAJAS 
❖ Los resultados de algunas pruebas RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden 
no estar disponibles dentro de un periodo clínicamente relevante como para 
informar las decisiones de gestión clínica. 
❖ La RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden no estar disponibles en todas las 
salas de emergencia o entornos ambulatorios. Para los pacientes hospitalizados, 
estos ensayos no siempre están disponibles en el lugar. o Es posible que las 
muestras respiratorias tengan que enviarse a un laboratorio estatal de salud 
pública o laboratorio comercial para RT-PCR. Por consiguiente, aunque la 
prueba puede arrojar resultados en 4-8 horas, el tiempo real para recibir los 
resultados puede ser mucho mayor. 
 
 
❖ La mayoría de los ensayos moleculares autorizados por la FDA no están 
aprobados para las muestras de las vías respiratorias inferiores 
❖ Por lo general, RT-PCR y otros ensayos moleculares son más costosos que otras 
pruebas de influenza 
❖ Algunos ensayos 
moleculares pueden no 
identificar de manera 
específica todos los 
subtipos de virus de 
influenza A que circulan 
actualmente. Según la 
prueba, un resultado 
negativo de un subtipo de 
virus de influenza A no 
descarta la infección con 
otro subtipo de virus de influenza A. 
❖ Algunos ensayos moleculares de influenza que se utilizan no están autorizados 
por la FDA y no se ha realizado una evaluación para conocer la precisión de todos 
los RT-PCR y ensayos moleculares disponibles 
❖ Los ensayos moleculares de detección rápida pueden tener una sensibilidad 
levemente menor para detectar los virus de la influenza, en relación con RT- 
PCR y otras pruebas moleculares. 
Realizado por: 
 
 
 
 
 NOUTHERN BLOT 
 
 
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ 
QUE DETECTA 
Northern blot es una técnica de laboratorio 
que se utiliza para detectar una secuencia 
de ARN específica en una muestra, 
secuencia de ARN específica en una 
muestra, permite también determinar el 
tamaño de la transcripción de ARN 
mensajero. 
 
PRINCIPIO 
Permite también determinar el tamaño de la transcripción de ARN mensajero. 
PROCEDIMENTO 
El procedimiento involucra electroforesis del 
ARN total o ARN poli-A junto con marcadores de 
pesos moleculares, para separar moléculas por 
tamaño. Las muestras de ARN son disueltas en 
buffers que contienen formamida y la 
electroforesis es llevada a cabo en un gel que 
contiene formaldehido. El formaldehído y la 
formamida son fuertes agentes desnaturalizantes 
que rompen la estructura secundaria del ARN, las 
cuales pueden dificultar la migración (Pedro L. Fernández Ruiz., 2010). Por lo tanto, 
moléculas de ARN linealizadas pueden ser separadas y visualizadas por tinción con 
colorantes fluorescentes como colorantes de bromuro de etidio y cianina SYBR verde. 
Al igual que en el Southern el Southern blot, el blot, el ARN se transfiere a transfiere a 
la membrana la membrana de filtro de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada. 
Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm 
correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S) Electroforesis de ARN donde destaca 
gran cantidad de ARN correspondiente a lasunidades 28S y 18S ribosomales. Tanto la 
 
 
técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al haber sido 
sustituidas por técnicas derivadas de la PCR. 
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 
 Este procedimiento provee información visual sobre la longitud de migración de las dos 
bandas de rARN distintas, de 28S y 18S; de aproximadamente 5 y 2Kb respectivamente. 
También provee información de la cantidad de ARN en el gel. A partir del gel, el ARN 
se transfiere a una matriz sólida (generalmente (generalmente hecha de membrana de 
nitrocelulosa o de nylon) por difusión capilar o electro transferencia, e inmovilizada por 
cross-linking bajo la radiación de luz ultravioleta. Las membranas son hibridizadas con 
sondas de ácidos nucleicos marcados específicamente. Después de la hibridación, la 
membrana se lava y las bandas hibridizadas pueden ser visualizadas por una auto 
radiografía. 
 VENTAJAS 
❖ La muestra de ARN requiere de un mínimo procesamiento 
❖ La técnica puede ser fácilmente evaluada (degradación, límite de detección) 
❖ Nos permite reconocer el análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de 
enzimas y en la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de 
células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico. 
DESVENTAJAS 
❖ Es menos precisa que la RT-PCR (Retro PCR). 
❖ Es una técnica que consume mucho tiempo montarla y necesita de mucho 
cuidado cuando se usan sondas radioactivas. 
❖ Es una técnica que consume mucho tiempo montarla y necesita de mucho 
cuidado cuando se usan sondas radioactivas. 
Realizado por: 
 
 
 
 SOUTHERN BLOT 
 
 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES 
OBJETIVO Se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN 
específicos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos. 
DETECTA Se utiliza para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de 
sangre, esputos, tejido y células. 
PRINCIPIO 
El proceso implica la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis 
a una membrana portadora que normalmente es nitrocelulosa y la posterior detección del 
fragmento de ADN diana mediante la hibridación de la sonda. La hibridación se refiere 
al proceso de formación de una molécula de ADN bicatenario entre una sonda de ADN 
monocatenario y un ADN diana monocatenario. Dado que la sonda y el ADN diana son 
complementarios entre sí, la reacción es específica, lo que ayuda a detectar el fragmento 
de ADN específico. 
PROCEDIMIENTO 
Es una técnica simple y fácil de realizar que detecta fragmentos de DNA, separados por 
tamaño mediante electroforesis en gel. Combina la separación electroforética del DNA 
con su transferencia a un soporte solido o “filtro” (nylon o nitrocelulosa) para su 
hibridación. Tanto esta como la posterior detección se realizan de forma más eficaz en 
el filtro de lo que se haría en el gel. Esta técnica ha contribuido de forma notable a 
aumentar la potencialidad de la hibridación como herramienta analítica, constituyendo 
el método habitual de análisis del DNA extraído de muestras de sangre. Esputo, tejido y 
células (linfocitos, amniocitos). 
1. Separación electroforética 
2. Desnaturalización 
3. Transferencia 
4. Hibridación 
5. Detección 
 
 
INTERPRETACIÓN: 
Una enzima de restricción se utiliza 
para cortar una muestra de ADN en 
fragmentos que se separan mediante 
electroforesis en gel. Los fragmentos 
de ADN son transferidos del gel a la 
superficie de una membrana. La 
membrana se expone a una sonda de 
ADN marcada con un marcador 
radiactivo o químico. Si la sonda se 
une a la membrana, entonces la secuencia de la sonda está presente en la muestra. 
VENTAJAS: 
❖ Altas especificidad y reproducibilidad. 
❖ Permitir la valoración del estado físico del ADN. 
DESVENTAJAS: 
❖ Cantidad relativamente alta de ADN. 
❖ Permite estudiar una pequeña región del genoma con cada sonda. 
❖ La mayoría de las sondas son poco informativas (heterocigosidad baja). 
 
 
 
 
 
 
Realizado por: