Práctica 3a Absorción de glúcidos y determinación de glicemia (2)

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
Primera Unidad
PRACTICA N° 03a
 - ABSORCIÓN DE GLÚCIDOS Y DETERMINACIÓN DE GLICEMIA --
INTRODUCCION:
La glucosa es la fuente de energía más importante del organismo, especialmente para algunos tejidos altamente especializados como el cerebro y los glóbulos rojos que constituyen su única fuente de energía. Por tanto, nuestro organismo dispondrá de una compleja maquinaria metabólica que asegure mantener constante la concentración de glucosa en la sangre y con ello, el aporte permanente de este sustrato a los tejidos.
 
La glucosa sanguínea, proviene de dos fuentes: una de origen exógeno de los alimentos, y otra de origen endógeno del hígado por glucogenólisis y de la gluconeogénesis. Se ha demostrado que la glucosa se gasta cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina; por tanto, la concentración de glucosa sanguínea dependerá del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. 
El mantenimiento constante de la concentración de glucosa sanguínea depende de la interacción de diversos factores como la absorción, producción endógena de glucosa, así como la utilización y excreción de la misma. El transporte de glucosa a través de la membrana apical de las células de la mucosa intestinal se realiza ligado al sodio, en un mecanismo dependiente de energía empleando una proteína transportadora para ambas moléculas llamada SGLT, requiriendo de alta concentración de sodio en la luz intestinal para que se realice dicho mecanismo.
El transporte de glucosa al interior de las células se realiza por un mecanismo diferente al que se lleva a cabo en las células intestinales; en el caso del hepatocito, célula muy permeable a la glucosa, el mecanismo estará asociado a difusión simple; mientras que, en la mayoría de los demás tejidos, en particular en el tejido adiposo, corazón y músculo esquelético dicho transporte estará dado por difusión controlada mediada por receptores asociados a la familia GLUT.
El conocimiento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia) es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. Los valores normales de glicemia son variables de acuerdo al método utilizado; según el método de Folin Wu los niveles varían entre los 80 – 120 mg%; mientras que con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 – 110 mg/dl.
En presente práctica se emplea la técnica del método enzimático para la determinación de la glucosa en sangre, la cual se fundamenta o está basada en la siguiente reacción:
POD
GOD
Glucosa + O2 + H2O		ácido glucónico + H2O2; 2H2O2 + 4-AF + 4-Hidroxibenzoato	 Quinonimina roja
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Demuestra la absorción y el metabolismo de los carbohidratos como la glucosa, cuantificando de manera responsable la glicemia pre y postprandial por el método de la glucosa oxidasa y de la peroxidasa.
MATERIAL, EQUIPO y REACTIVOS:
Material biológico: Suero o plasma sanguíneo humano.
Material de vidrio: Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1 ó de 2 mL.
Equipo de extracción de muestra: Guantes, alcohol, algodón, agujas N° 21G x 1 ½, jeringas x 5 cc.
Equipos: Centrífuga, micropipetas de 2-50 µL, baño maría, espectrofotómetro.
Reactivos:
· Reactivo A: Solución conteniendo glucosa oxidasa, peroxidasa, aminofenazona, hidroxibenzoato y buffer fosfato pH 7.
· Estándar: Solución de glucosa 1g/L (100 mg/dL)
PROCEDIMIENTO:
1) Obtención de la muestra:
Desinfectar la zona con alcohol y extraer de 3 a 5 mL de sangre de la vena de la flexura del codo utilizando una jeringa de 5ml y aguja hipodérmica N°21G x 1 ½. Dejar en reposo por 10 minutos para la coagulación de la sangre y centrifugar a 2,500-3,000 rpm durante 10 minutos. Separa el suero con una pipeta serológica de plástico descartable.
Si la muestra a utilizar fuese plasma extraer la sangre con un anticoagulante común (de preferencia EDTA-fluoruro de potasio o heparina). Mezclar suavemente; dejar en reposo durante 5 minutos y luego proceder como en el caso anterior.
Nota:
· Muestra preprandial: Se extraerá con la persona en ayuno de 4 a 8 horas.
· Muestra postprandial: Se extraerá después de la ingesta alimenticia, una hora después como máximo.
2) Sistema de incubación para la determinación de la glicemia: Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica:
	COMPONENTES y PROCESO
	TUBOS DE ENSAYO
	
	B
	St
	Pre (1)
	Post (2)
	Estándar (St)
	--
	10 uL
	--
	--
	Muestra preprandial (1)
	--
	--
	10 uL
	--
	Muestra postprandial (2)
	--
	--
	--
	10 uL
	Reactivo A
	1 mL
	1 mL
	1 mL
	1 mL
	Incubar 5 minutos a todos los tubos de ensayo en baño maría a 37 °C
	Observar la aparición de un color rojo-cereza en cada uno de los tubos.
	Leer en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivos (B), en el lapso de 30 minutos (tiempo en que el color de la reacción es estable). Anotar los resultados.
3) Valoración de la glucosa en sangre (glicemia):
Valoración cualitativa: Se realiza según la aparición de un compuesto cromogénico rojo-cereza (una quinonimina), el cual se forma de manera proporcional a la concentración de H2O2. Interpretar en base a la competencia.
Valoración cuantitativa: Con los datos de absorbancia se procede a realizar los cálculos respectivos y expresar los resultados en términos de glucosa por volumen de sangre: g/L o mg/dL. Interpretar en base a la competencia
RESULTADOS:
1) Valoración cualitativa de la glicemia:
2
1
S
B
	Evidencia-Indicador
	B (Blanco)
	Estándar (St)
	Preprandial (1)
	Postprandial (2)
	Color final (Rojo-cereza): +, ++
	———
	+
	+
	++
	Glicemia: Hipo / Normal / Hiper
	———
	———
	Normal
	Hiper
2) Valoración cuantitativa de la glicemia:
· Expresión de los resultados: Los resultados se expresan en términos de gramos de glucosa por litro de sangre (g/L) o en miligramos de glucosa por decilitro de sangre (mg/dL), lo cual se determina mediante la siguiente fórmula:
Glucosa = (Factor) (Lectura de la muestra)
Factor para g/L = ..................		Factor para mg/dL = ..................
Lectura St (Lectura de absorbancia del estándar de glucosa): 0.220
· Tabulación/Registro de los resultados:
	Muestra
	Lectura de absorbancia
	Glicemia: [Glucosa]
	
	
	g/L
	mg/dL
	Preprandial (1)
	0.225
	
	
	Postprandial (2)
	0.298
	
	
Interpretar los resultados según los valores de referencia: En suero o plasma (0.70 a 1.10 g/L ó 70 a 110 mg/dL).
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
2) Mediante un mapa mental, identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características.
3) Confeccione un cuadro comparativo explicando cómo afecta el ayuno y el estado posprandial a la concentración de la glucosa en sangre y que vía metabólica activa.
4) Esquematice un transportador de glucosa de la familia SGLT y GLUT,señalando sus componentes.
5) Analice los datos. Mujer de 54 años, que acude con las siguientes lecturas de absorbancia: Estándar = 0.240, Muestra preprandial = 0.446 y muestra postprandial = 0.523. Interprete y de una explicación bioquímica.
6) Con ayuda de textos alusivos al tema y el gráfico siguiente, identificar las principales vías del metabolismo de los glúcidos en el ser humano. Explicar sobre la importancia de tales vías en el mantenimiento de la salud en nuestro organismo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) ADA, estándares para Diabetes 2020. Diabetes Care.
Disponible: https://care.diabetesjournals.org/content/44/Supplement_1 
3) Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina. Disponible: http://files.wiener-lab.com/Vademecum_completo_espanol.pdf
4) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007.
5) Huamán J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretación. 2° edición, Trujillo 2018.
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.
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