IntroducciÃn al TP CinÃtica EnzimÃtica

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Cinética Enzimática
Introducción al Trabajo Práctico
1
Determinación de la actividad enzimática 
Actividad 
enzimática
Cantidad o concentración de:
‐ sustrato (S) transformado o 
‐ producto  (P) formado
por unidad de tiempo
Velocidad 
Vi depende de:
‐ concentración de enzima y sustratos
‐ T°, pH, fuerza iónica, presencia de 
inhibidores o activadores, cofactores
Actividad o velocidad
Vi
Actividad Específica
AE=Vi/proteína
Cantidad de P o S/tiempo:
µmol/min (especificar volumen 
de reacción)
Concentración de  P o S/tiempo:
mM/min
‐ A partir de Vi en cantidad/tiempo: 
Se divide por cantidad de proteína
(µmol/min)/mg
‐ A partir de Vi en concentración/tiempo:
Se divide por concentración de proteína
(mM/min)/(mg/mL) = µmol min‐1 mL‐1/(mg mL‐1)
En ambos casos queda µmol min‐1 mg‐1
Ensayo de 
actividad 
enzimática
Realizado bajo condiciones 
experimentales controladas
Ejemplos de formas en 
que pueden encontrar 
expresada la actividad 
de una enzima
[P]
tiempo
Velocidad inicial (Vo o Vi)
V=d[P]/dt
Antes de plantear el trabajo práctico a realizar, se discutirán cuestiones generales relacionadas con la
determinación de la actividad de una enzima.
Los ensayos de actividad enzimática consisten en la determinación del sustrato consumido o el producto
formado en el tiempo, es decir, de la velocidad de reacción.
En el seminario se discutieron las curvas de progreso de una reacción en el tiempo y se definió la
velocidad inicial como la velocidad a tiempo tendiendo a cero, que en la práctica se mantiene constante al
inicio de la reacción y se puede obtener a partir de la pendiente de la zona lineal de la curva de [P] vs
tiempo.
Dado que la velocidad depende de las condiciones en las que se realiza el ensayo (concentración de
enzima y sustratos, temperatura, pH, etc.), es necesario conocer y especificar las condiciones
experimentales empleadas.
En el cuadro se muestran ejemplos de diferentes formas en que se puede expresar la actividad de una
enzima.
2
Determinación de la actividad enzimática 
Propósitos
Estimar la actividad como 
reflejo de la cantidad de 
enzima en una muestra
Determinación de actividad 
de enzimas en suero para 
diagnóstico y seguimiento 
de enfermedades. 
La enzima no está pura, no 
se conoce su concentración.
Estimar la actividad 
específica de una 
preparación enzimática
Seguimiento de la purificación 
de una enzima. 
Se calcula  la actividad específica  
en diferentes fracciones.
Caracterizar una enzima:
Estimar parámetros cinéticos 
Estudiar mecanismo de Rn
Determinación de la actividad 
en diferentes condiciones. 
Los ensayos más frecuentes se 
realizan en condiciones de 
estado estacionario para 
estimar parámetros cinéticos 
(KM, kcat).
Estado estacionario => Vi La Vi refleja la cantidad de enzima activa
Vi
[E]
Vi
[S]
Vmax
Vmax/2
KM
Los ensayos de actividad enzimática se pueden realizar con distintos propósitos, que definirán también el
tipo de diseño experimental. En esta diapositiva se muestran algunos ejemplos representativos.
El objetivo puede ser estimar los parámetros cinéticos característicos para una enzima con un sustrato
dado en el marco de los estudios de caracterización de una enzima, o se podría evaluar cómo se ven
afectados por un inhibidor. En esos casos, se realizan ensayos en los que se mide la Vi a diferentes [S].
Otro objetivo puede ser estimar la actividad de una enzima en una muestra como reflejo de la cantidad
de enzima en la misma. Un ejemplo sería la determinación de la actividad enzimática en suero. Muchas
enzimas se encuentran normalmente en el interior celular, no en la circulación sanguínea, pero ante un
daño celular se liberan a la circulación. Por lo tanto, una forma de evaluar si esas enzimas se liberaron a la
circulación es medir su actividad en suero, que es más sencillo que medir directamente la concentración
de enzima. La actividad se expresa de diferentes formas según el ensayo en cuestión, pero esas formas
hacen referencia a la velocidad de reacción. Suele expresarse la actividad como unidades por litro (U/L), y
la unidad se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de cierta cantidad de
sustrato en producto por unidad de tiempo bajo determinadas condiciones experimentales.
El último propósito que discutiremos consiste en la determinación de la actividad enzimática para calcular
su actividad específica en una muestra. La actividad específica sería la velocidad inicial relativizada a la
cantidad de proteína presente en la preparación enzimática. Esto es útil, por ejemplo, durante el proceso
de purificación de una enzima, como discutirán en el Módulo de Purificación de Proteínas. La actividad
específica es un dato muy importante también a considerar cuando se debe utilizar una enzima. En
general, para enzimas comerciales en el frasco el proveedor informa la cantidad de producto, su pureza y
su actividad específica. No siempre tener la misma cantidad de enzima total implica tener la misma
cantidad de enzima activa. Suele haber variabilidad en la actividad específica entre lotes debido a
cuestiones inherentes al proceso de producción que pueden alterar la integridad de la estructura proteica
de la enzima y una proporción de las moléculas puede perder actividad.
En los dos últimos propósitos que describimos, el concepto de fondo es que la Vi refleja la cantidad de
enzima activa, ya que existe una relación lineal entre la Vi y la [E]. En general, estos ensayos se realizan a
una [S] fija, y a una sola [E] (no es necesario realizar la curva de Vi vs [E], eso depende del objetivo
particular del ensayo). Nótese que para cualquiera de los propósitos que discutimos, la velocidad a
determinar debe corresponder a la velocidad inicial.
3
La velocidad a determinar debe ser Vi
Sólo en la zona lineal de la curva Vi 
se puede calcular como
Cálculo de Vi
 Curva de tiempo con varios puntos experimentales: a partir de la pendiente de la zona lineal
 Ensayo con un único tiempo de reacción:  se calcula como [P] formado en ese tiempo. Es 
indispensable  en este caso realizar ensayos previos que permitan establecer el tiempo de 
reacción a utilizar para asegurarse de estar dentro de la zona lineal y medir Vi. 
[P
ro
d
u
ct
o
] 
   
   
 
Tiempo
En rojo: la pendiente 
calculada como 
∆[P]/∆t NO sería Vi
[P
ro
d
u
ct
o
]
Tiempo
Fase de 
velocidad 
inicial
La velocidad inicial se calcula a partir de la pendiente de la zona lineal de la curva de [P] vs tiempo.
En ensayos en los que se determina la [P] a distintos tiempos de reacción, se puede entonces evaluar si el
aumento en la [P] es lineal durante todo el intervalo de tiempo medido, o durante un intervalo menor, y
calcular la pendiente a partir de los puntos comprendidos en la zona donde la velocidad es constante,
como se muestra en la figura de la izquierda.
En ciertos ensayos, sin embargo, por cuestiones relacionadas al método de detección o al diseño
experimental, la aparición de producto se determina a un único tiempo de reacción, para entonces
calcular la Vi como el producto formado en ese tiempo. En esos casos, es necesario asegurarse de que el
tiempo de reacción esté comprendido en el intervalo de linealidad en la aparición de producto en el
tiempo. En el gráfico de la derecha, se muestra cómo se modifica la pendiente calculada como ∆P/∆t para
diferentes tiempos. Nótese que para los puntos en rojo, el valor de la pendiente es menor que el obtenido
para el punto azul, ya que los tiempos no se encuentran dentro de la zona lineal de la curva. Entonces, las
pendientes calculadas como ∆P/∆t [([P]t=x‐[P]t=0)/tiempo de reacción] no corresponden a velocidad inicial
para los tiempos que se marcan en rojo. Es importante entonces realizar ensayos previos para saber hasta
qué tiempo se mantiene lineal la aparición de producto en el tiempo y definir el tiempo que se dejará
transcurrir la reacción para medir Vi.
4
Sustratos para medir actividad de fosfatasa alcalina
p‐nitrofenil fosfato: 
‐ permite una medición continua de la reacción ya queel producto es coloreado
‐ se utiliza en muchos kits comerciales para determinar la actividad de FAL en suero 
(laboratorios de análisis clínicos)
Fenil fosfato: 
‐ el producto de la reacción no es coloreado, de modo que se agregan reactivos de 
color que permiten la detección del fosfato liberado
‐ los reactivos de color detienen la reacción enzimática al momento de agregarlos, de 
manera que el seguimiento de la reacción no es continuo como en el caso anterior, 
sino que se trata de una medición discontinua (reacción de punto final)
TRABAJO 
PRÁCTICO
ESTUDIO CINÉTICO DE UNA REACCIÓN 
CATALIZADA POR LA  FOSFATASA ALCALINA
En el TP utilizaremos como sustrato  fenil fosfato
IMPORTANTE PARA EL DISEÑO EXPERIMENTAL
En el trabajo práctico de la materia se mide la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Antes de
profundizar en los detalles del TP, discutiremos algunos aspectos importantes de los ensayos de
determinación enzimática, tomando como ejemplo a esta enzima.
A menudo las enzimas catalizan una misma reacción (por ejemplo, desfosforilación) para más de un
sustrato. Es importante recordar que los parámetros cinéticos son característicos para una enzima con un
sustrato dado. La elección del sustrato a utilizar depende del objetivo del ensayo y, en algunos casos, de
cuestiones metodológicas inherentes a las características de los sustratos y de sus productos de reacción.
Para el caso de la fosfatasa alcalina, en la diapositiva se muestran dos sustratos que se suelen utilizar para
la determinación de su actividad. Nótese que en un caso el producto de reacción es coloreado y es posible
entonces realizar una medición continua de la reacción en el tiempo. En cambio, en el otro caso al ser
necesario agregar un reactivo de color para detectar el producto, que pone fin a la reacción porque
inactiva a la enzima, la medición es discontinua.
En el TP utilizaremos como sustrato fenil fosfato, de modo que la medición será discontinua y esto
impactará en el diseño experimental, como se discutirá más adelante. En la próxima diapositiva se
muestra en más detalle a modo de ejemplo cómo es la determinación de la actividad de la fosfatasa
alcalina utilizando el p‐nitrofenil fosfato como sustrato en un ensayo de medición continua.
5
Ensayo continuo de determinación  de la actividad enzimática
Ejemplo de aplicación clínica 
Se pueden agregar los reactivos en la cubeta y realizar el 
seguimiento de la reacción en el espectrofotómetro
1) + Buffer
2) + Sustrato (pNPP)
En el espectrofotómetro 
3) Registro de línea de base
4) + FAL (suero): inicio de reacción
5) Registro de Abs en el tiempo
p‐nitrofenil fosfato (pNPP)
(incoloro)
p‐nitrofenol 
(amarillo)
Fosfatasa 
alcalina (FAL)
 Se puede obtener una curva de tiempo a partir de un 
único “tubo” de reacción
 La Vi se calcula a partir de la pendiente de la zona 
lineal del gráfico (con la absortividad o coeficiente de 
extinción molar y el paso de luz se puede transformar la 
variación de Abs en variación de concentración)
FAL
A
b
so
rb
an
ci
a 
(4
0
5
 n
m
)
Tiempo (min)
pendiente= ∆Abs/ ∆t → Vi  
Este ensayo se realiza de rutina en laboratorios de análisis clínicos para determinar la actividad de la
fosfatasa alcalina en suero de pacientes. Esta enzima está presente en el interior celular, principalmente
en hígado y huesos, y es liberada al torrente sanguíneo cuando dichos tejidos se dañan, de manera que su
determinación en suero es útil para la detección de enfermedades hepáticas y óseas.
Se agrega suero del paciente a un medio de reacción que contiene el sustrato. Al ser el producto de la
reacción coloreado, se puede realizar la reacción directamente en una cubeta del espectrofotómetro
(mantenida a la temperatura de reacción), y monitorear el aumento de la absorbancia a distintos tiempos,
como se muestra en la diapositiva.
6
TRABAJO PRÁCTICO
ESTUDIO DE LA FOSFATASA ALCALINA EN CONDICIONES DE ESTADO ESTACIONARIO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40
P
i (
m
M
)
tiempo (min)
Vmax , KM y kcat 
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0 2 4 6 8 10 12
V
i (
m
M
/m
in
)
[S] (mM)
Objetivo general
Determinar la dependencia de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina con 
la concentración del sustrato fenilfosfato en condiciones de estado estacionario
Reactivo de 
Fiske‐Subbarow
Medición discontinua
TP I TP II
Leer de la Guía de Trabajos Prácticos los objetivos, introducción, descripción de la
metodología y análisis de resultados.
Para realizar un estudio de la reacción enzimática de interés en condiciones de estado estacionario y
estimar los parámetros cinéticos KM y kcat, es necesario realizar un ensayo en el que se evalúe cómo se
modifica la velocidad inicial con la concentración de sustrato (Curva Vi vs [S]) (es lo que realizaremos en el
TP II). El diseño de este ensayo consiste en incubar distintos tubos con una [E] fija constante y [S] variable.
La velocidad inicial se calculará a partir de la determinación de cuánto producto de la reacción (fosfato
inorgánico en este caso) se forma en un tiempo dado (∆[P]/∆t). Para cuantificar el fosfato libre se utilizará
el reactivo colorimétrico Fiske‐Subbarrow, que al agregarse al tubo detiene la reacción enzimática y
genera un complejo coloreado con el fosfato libre que puede ser cuantificado mediante la determinación
de la Abs a 710 nm.
El tiempo de reacción será el mismo para todos los tubos y deberá estar comprendido dentro del intervalo
de linealidad de aparición de producto en el tiempo para cada [S], de manera que la velocidad
determinada corresponda a la inicial. Para definir el tiempo de incubación se deberá primero determinar
la aparición de producto en el tiempo y estimar la duración del intervalo de linealidad (es lo que
realizaremos en el TP I). La curva de [P] vs tiempo se llevará a cabo incubando tubos con concentración de
sustrato y de enzima fijas durante distintos tiempos, de manera de poder cuantificar la concentración de
producto generado a distintos tiempos de reacción.
No se realizará una curva de tiempo para cada una de las [S] que se utilizarán para el ensayo de Vi vs [S],
ya que experimentalmente sería muy laborioso, y porque tampoco es necesario. Teniendo en cuenta que
el intervalo de linealidad aumenta con la [S], la curva de [P] vs tiempo se realizará con la menor [S], que
sería la condición en la cual el intervalo de linealidad es menor. Entonces, si se elige un tiempo de reacción
que está comprendido dentro del intervalo de linealidad para la menor [S], ese mismo tiempo estará
también comprendido dentro del intervalo de linealidad para las [S] mayores.
Por ejemplo, supongamos que para la mayor [S] a utilizar la aparición de producto en el tiempo es lineal
hasta los 30 minutos y para la menor [S] a utilizar es lineal hasta los 6 minutos. Entonces, si se elige un
tiempo de incubación menor a 6 minutos (5 minutos por ejemplo), para todas las [S] a ensayarse la
velocidad calculada como producto formado en 5 minutos corresponderá a la inicial. Por lo tanto, no es
necesario conocer el intervalo de linealidad en la aparición de producto en el tiempo para todas las [S],
sólo para aquella en la cual dicho intervalo será menor, que corresponde a la menor [S].
7
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40
P
i (
m
M
)
tiempo (min)
Duración del intervalo de linealidad
Vi
TP I
Para tres concentraciones de enzima
Elegir:
 [E]
 tiempo de incubación
a utilizar para la curva de sustrato (TP II)
Gráfico de Vi en función de [E]
Objetivo: 
Determinar el intervalo de tiempo en el cual se cumple la condición de velocidad inicial
En el primer trabajo práctico se estima el intervalo de tiempo en el cual la aparición de producto es lineal
en el tiempo, durante el cual se puede entonces determinar la velocidad inicial. Brevemente, se mide la
aparición de producto en el tiempo en medios de reacción conteniendo E y S en concentración fija. Como
la medición es discontinua (el reactivo que se usa para detectar el fosfato libredetiene la reacción
también), se preparan varios tubos de reacción iguales pero con distinto tiempo de incubación. Se
ensayarán tres concentraciones de E distintas.
Análisis de las curvas de tiempo:
Para estimar la duración del intervalo de linealidad se observa hasta qué tiempo se mantiene la recta
inicial del gráfico [P] vs tiempo. Una forma un poco más exacta es calcular los valores de pendiente desde
0 hasta cada tiempo y graficar pendiente vs tiempo y estimar hasta qué tiempo ese valor se mantiene
contante.
Se obtendrán distintos intervalos de linealidad para las tres [E] a utilizar. Se elige con cuál trabajar en base
a los tiempos que se obtengan y cómo es el protocolo a seguir para realizar el ensayo de Vi vs [S]. Si se
elige una [E] muy baja la duración del intervalo de linealidad es quizás alta, lo cual nos permite trabajar
cómodamente, pero pueden requerirse tiempos de incubación largos para generarse una cantidad de
producto detectable con confianza según la sensibilidad del método que se utilice. Por el contrario, si se
trabaja con [E] elevada, puede generarse mucho producto en poco tiempo y el intervalo de linealidad ser
muy corto, hecho que hace que se deban utilizar tiempos de reacción muy cortos y puede ser complicado
llevar a cabo el protocolo dependiendo de la cantidad de tubos. Se ensayarán tres [E] y se evaluará si para
la curva de Vi vs [S] es más conveniente trabajar con alguna de ellas. En caso de que se pueda utilizar más
de una de las [E] ensayadas, se definirá el tiempo de reacción para cada una.
El gráfico de Vi vs [E] debe dar una recta, es el comportamiento esperado para [E] diluidas. De no ocurrir
esto, habría que revisar las condiciones experimentales, diversos factores pueden producir desviaciones.
8
TP I
Tubos de reacción:
 0,5 ml de sustrato 2 mM
 0,5 ml de enzima (40, 20 o 5 µg/ml)
(preparadas en buffer de reacción)
1 tubo para cada tiempo de reacción
Fiske‐Subbarow
Sustrato
(1 mM)
Fenilfosfato +    H2O Fenol +      Fosfato
FAL
Enzima
(20, 10 o 2,5 µg/ml)
Producto
Detiene la reacción
Coloración azul
Abs 710 nm
A
b
s 
7
1
0
 n
m
[fosfato] (mM)
Tubos con fosfato patrón (0 a 1 mM)  
para la curva de calibración
Incubación a 37 °C
Diferentes tiempos
(0‐40 min)
Tubos control:
 Buffer 
 Enzima 
 Sustrato (sin incubar)
 Sustrato (incubado al > tiempo de reacción utilizado)
Reactivo de 
Fiske‐Subbarow
Cálculo de la concentración de fosfato 
en cada tubo de reacción
En esta diapositiva se resume el protocolo correspondiente al TP I, que se encuentra detallado en la Guía.
La reacción se lleva a cabo utilizando el sustrato en una concentración final 1 mM y la enzima en una
concentración final fija que puede ser 20, 10 o 2,5 µg/ml según el grupo (cada alumno trabaja con una
concentración de enzima, luego se comparten los resultados y se obtienen valores promedio para cada
concentración).
Los tubos de reacción contienen 0,5 ml de sustrato 2 mM y 0,5 ml de enzima 40, 20 o 5 µg/ml, de manera
que al diluirse ambas soluciones al medio se llega a las concentraciones antes mencionadas. Las
soluciones de enzima y sustrato están preparadas en el buffer de reacción.
Los tubos de reacción se incubarán a diferentes tiempos y la reacción se detendrá por el agregado del
reactivo de color (Fiske‐Subbarow). Para poder cuantificar la cantidad de fosfato, se incluyen tubos con
distintas concentraciones de fosfato patrón que permiten realizar una curva de calibración. Aparte, es
necesario incluir tubos control para evaluar si las soluciones de enzima, sustrato o el buffer en el que
están preparadas contienen fosfato contaminante, que sería erróneamente cuantificado como producto
de la reacción. Se controla también si el sustrato se hidroliza al incubarse durante un tiempo en ausencia
de enzima, ya que dicho producto no correspondería al de la reacción catalizada por la enzima sino al de la
reacción sin catalizar.
En caso de que los controles den valores positivos, se deben realizar correcciones para descontar los
fosfatos que no son producto de la reacción catalizada por la enzima, que se discutirán en detalle con el
docente el día que realicen el TP (en el problema adicional 5 pueden encontrar un ejemplo de cómo
procesar los datos y analizar los controles). Los resultados de estos controles en general indican que las
soluciones empleadas no contienen fosfatos contaminantes significativos y que la hidrólisis del sustrato en
ausencia de enzima no ocurre o es despreciable en las condiciones experimentales del ensayo.
9
Hoja de ruta
IMPORTANTE:
 La reacción enzimática se inicia cuando se ponen en contacto enzima y
sustrato en el tubo, que inmediatamente se incuba a 37°C
 Al agregar el reactivo de Fiske‐Subbarow se detiene la reacción y comienza
la generación de color
 Es importante que para todos los tubos del ensayo transcurra
aproximadamente el mismo tiempo desde que se agrega el reactivo de
color hasta que se mide la absorbancia en el espectrofotómetro
¿Cómo hacemos para coordinar los tiempos de agregado de reactivos para
iniciar y detener la reacción de modo que la misma transcurra durante el
tiempo estipulado para cada tubo, y que luego las medidas de absorbancia de
los diferentes tubos se puedan realizar al mismo tiempo (uno tras otro)?
10
Guía de TP, páginas 17 y 18
HOJA DE RUTATABLA I
PROTOCOLO TP I
Estimación del intervalo de tiempo para la medida de velocidad inicial
1°
2° 3°
4°5°
6°
Lo primero que se hace es cargar los tubos con agua y fosfato, enzima o buffer según se indica en la Tabla
I. Esto lo realizan en los espacios de mesada asignados según la alacena.
Luego deben ubicarse cerca de un baño termostatizado y llevar los materiales y reactivos necesarios para
continuar con el protocolo en el espacio de mesada al lado del baño.
La reacción en cada tubo se inicia por el agregado de 0,5 ml de sustrato (inmediatamente después se
transfiere el tubo al baño de 37°C) y se detiene con 3 ml del reactivo de Fiske‐Subbarow. La lectura de
absorbancia a 710 nm se realiza en el mismo orden de agregado del reactivo de Fiske‐Subbarow.
La hoja de ruta indica, para cada tubo, el tiempo de reacción estipulado, el tiempo en que se agregará el
sustrato a cada uno (inicio de la reacción enzimática) y el tiempo en que se agregará el reactivo de Fiske‐
Subbarow (detención de la reacción enzimática y generación de color que permite la detección de
fosfatos libres). Para mayor facilidad, en rojo se muestra el orden de agregado de sustrato o Fiske‐
Subbarow a los tubos según el tiempo correspondiente.
Nótese que la diferencia entre el “tiempo de corte de reacción” y el “tiempo de inicio de la reacción”
corresponde al “tiempo de reacción”. En la guía de TP se explica en más detalle el uso de la hoja de ruta.
11
Lineamientos para el procesamiento de resultados del TP I
Atención: agregar unidades 
de la pendiente en la 
ecuación de la recta (según 
unidades del eje X)
Controles
Tubos de 
reacción
Calcular a partir de la ecuación de la curva de calibración el fosfato presente en cada tubo.
Según este valor y los resultados de los controles, calcular el producto  generado (se puede 
expresar como cantidad o como concentración de Pi)
Calcular a partir de la ecuación de la curva de calibración el fosfato presente en los tubos control 
(se puede expresar como cantidad o como concentración de Pi)
Tubos con 
fosfato 
patrón
µmol/ml = mM
Como el volumen de reacción es 1 ml, coincide
numéricamente el valor de la cantidad de fosfato
expresada en µmoles con su concentración en mM
 Curva de producto en función del tiempo
 Estimación del intervalo de linealidad y cálculo de Vi 
 Resultados individuales para una concentración de enzima
 Resultados grupales por comisión para las tres concentraciones de enzima
 Curvas de producto en función del tiempo y de pendiente en función del tiempo
 Estimación del intervalo de linealidad y cálculo de Vi para cada concentración de enzima
 Gráfico de Vi en función de la concentración de enzima
Aquí se presentaun esquema del procesamiento de los resultados del primer TP. En la guía de TP figuran los
lineamientos para el análisis de los resultados. En el campus pueden encontrar las indicaciones generales para el
procesamiento de controles y para la confección del informe.
El informe constará de dos partes. En la primera, analizarán los resultados que obtuvieron a partir de los valores de
Abs de los tubos que procesaron ustedes (correspondientes a una concentración de enzima). En la segunda, realizarán
el análisis de los resultados promedio de la comisión para las tres concentraciones de enzima.
En el campus estarán disponibles los resultados promedio de la comisión correspondientes a la concentración de
producto generado para cada tiempo, para las tres concentraciones de enzima. Deberán confeccionar las curvas de
producto en función del tiempo y de pendiente en función del tiempo para cada concentración de enzima. A partir
del análisis de estas curvas, se puede calcular la Vi (pendiente de la zona lineal de la curva de producto en función del
tiempo) y estimar el intervalo aproximado de linealidad (periodo de tiempo en el cual la curva de producto vs tiempo
es lineal, la pendiente es constante y corresponde a Vi). La curva de pendiente en función del tiempo se realiza a
partir de los valores de pendiente de la curva de producto vs tiempo, calculados desde tiempo cero hasta cada tiempo
en particular. Esta pendiente no corresponde a la “velocidad instantánea” sino que representaría una velocidad
promedio desde tiempo cero hasta el tiempo en cuestión.
Deberán confeccionar el grafico de Vi en función de la concentración de enzima para verificar que Vi aumenta de
forma lineal con la concentración de enzima, que es el resultado esperado, y confirmaría que, en principio, es factible
trabajar con cualquier concentración de enzima comprendida en ese rango.
Para elegir con qué concentración de enzima trabajar durante el segundo trabajo práctico, es importante tener
presente el protocolo del segundo TP y la duración del intervalo linealidad para cada enzima obtenido en el primer
TP. Se debe escoger una concentración de enzima para la cual el intervalo de tiempo de linealidad sea suficiente para
que un solo operador pueda iniciar y detener la reacción en todos los tubos sin que se superpongan los tiempos y sin
la necesidad de trabajar demasiado rápido, lo cual podría llevar a cometer errores. Según el protocolo del TP II, se
necesitan al menos 4 min para iniciar y detener la reacción en todos los tubos si se quiere un desfasaje de 30
segundos entre un tubo y el siguiente.
12
Transformación de las dobles recíprocas
y = 16,45 min X + 7,524 min/mM
R² = 0,998
0
5
10
15
20
25
30
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
1/
V
i (
m
in
/m
M
)
1/[S] (mM-1)
TP II Objetivo: 
Determinar la velocidad de hidrólisis de fenilfosfato por la fosfatasa alcalina en 
función de la concentración de sustrato y estimar los valores de Vmax, kcat y KM
Vmax
KM 
kcat
ajuste de la ecuación de Briggs y Haldane a los 
valores experimentales de Vi para cada [S] 
(regresión no lineal)
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0 2 4 6 8 10 12
V
i (
m
M
/m
in
)
[S] (mM)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0 2 4 6 8 10 12
V
i (
m
M
/m
in
)
[S] (mM)
Ahora nos centraremos en el TP II, cuyo objetivo específico se muestra en esta diapositiva.
A partir del ajuste de la ecuación de una hipérbola rectangular a los valores experimentales de Vi para las
[S] ensayadas se pueden obtener los parámetros Vmax y KM, y se puede calcular kcat conociendo la [E]
utilizada.
Para poder realizar dicho ajuste, hay que primero verificar que el comportamiento de los puntos
experimentales de Vi para las [S] ensayadas pueda ser descrito por la ecuación de una hipérbola
rectangular (si dieran otra forma, como una sigmoidea por ejemplo, no sería correcto). No siempre es tan
sencillo darse cuenta de esto a partir de la representación gráfica de los puntos de Vi vs [S] (según el rango
de [S] utilizadas, una curva de tipo sigmoidea u otras podrían parecer hipérbolas).
La transformación de las dobles recíprocas (dobles inversas) puede resultar útil en este sentido, ya que si
al graficar los valores de 1/Vi vs 1/[S] los puntos ajustan a una recta, entonces los puntos de Vi vs [S]
pueden ser descritos por la ecuación de una hipérbola rectangular y, entonces, es correcto realizar el
ajuste no lineal de la ecuación de Briggs y Haldane a los valores de Vi para cada [S].
Aparte, en el caso de que no se disponga de los medios para realizar un ajuste no lineal (nosotros lo
haremos con el complemento de Excel Solver), la transformación de las dobles inversas puede utilizarse
para estimar los valores de Vmax y KM.
13
Sustrato
(1 a 10 mM)
Fenilfosfato +    H2O Fenol +      Fosfato
FAL
Enzima
(10  o 2,5 µg/ml)
Producto
Detiene la reacción
Coloración azul
Abs 710 nm
Reactivo de 
Fiske‐Subbarow
TP II
Tubos de reacción:
 0,5 ml de sustrato (2 a 20 mM)
 0,5 ml de enzima (20 o 5 µg/ml)
(preparadas en buffer de reacción)
Fiske‐Subbarow
A
b
s 
7
1
0
 n
m
[fosfato] (mM)
Tubos con fosfato patrón (0 a 1 mM)  
para la curva de calibración
Incubación a 37 °C
Único tiempo 
Tubos control:
 Buffer 
 Enzima 
 Sustrato (> [S] a utilizar) 
 Cálculo de la concentración de 
fosfato en cada tubo de reacción
 Cálculo de la Vi para cada [S]
En esta diapositiva se muestra un resumen del protocolo correspondiente al TP II, que se detalla en la
Guía. En líneas generales es parecido al del TP I pero ahora el tiempo de reacción es fijo y lo que se
modifica es la [S] utilizada.
A partir de la curva de calibración se puede calcular la concentración de fosfato en cada tubo. En caso de
que los controles dieran valores positivos deberían realizarse correcciones para descontar el fosfato que
no es producto de la reacción enzimática. En este protocolo no se incluye el control de sustrato incubado,
ya que a partir del análisis de los resultados del TP I se puede comprobar que en las condiciones
experimentales empleadas no se detecta hidrólisis del sustrato no catalizada por la enzima apreciable.
Se calcula la Vi para cada [S] conociendo la [P] formado en el tiempo de reacción que se haya utilizado.
Con los valores de Vi para cada [S] pueden realizar los gráficos y estimar los parámetros cinéticos, como se
discutió previamente.
14
Guía de TP, página 21
TABLA II
PROTOCOLO TP II
Determinación de la velocidad inicial de una reacción enzimática 
en función de la concentración de sustrato
En esta diapositiva se muestra la Tabla II que figura en la Guía, correspondiente al protocolo del TP II.
¿Cuáles serían los tubos correspondientes a la curva de calibración? ¿los controles? ¿y los tubos de
reacción?
Se cargarán primero los tubos con agua, fosfato patrón, buffer y las diferentes soluciones de sustrato
según se indica en la Tabla II. Esto lo realizan en los espacios de mesada asignados según la alacena. Luego
deben ubicarse cerca de un baño termostatizado y llevar los materiales y reactivos necesarios para
continuar con el protocolo en el espacio de mesada al lado del baño.
La reacción en cada tubo se inicia por el agregado de 0,5 ml de enzima (inmediatamente después se
transfiere el tubo al baño de 37°C) y se detiene con 3 ml del reactivo de Fiske‐Subbarow. La lectura de
absorbancia a 710 nm se realiza en el mismo orden de agregado del reactivo de Fiske‐Subbarow.
Este protocolo, que implica incubar los tubos de reacción durante un intervalo de tiempo fijo, es más
sencillo de realizar operativamente que la curva de tiempo del primer TP. Si se desea que la reacción se
inicie (y detenga) entre tubo y tubo cada 30 segundos, y considerando el tiempo de reacción deseado,
confeccione usted la hoja de ruta (indique para cada tubo de reacción a qué tiempo agregará la enzima
para iniciar la reacción y a qué tiempo agregará el reactivo de Fiske‐Subbarow para detenerla; recuerde
que el reactivo de color se debe agregar a todos los tubos del protocolo).
A partir de los valoresde absorbancia para cada tubo de reacción, de la concentración de enzima utilizada
y del tiempo de reacción, podrán realizar los cálculos necesarios y confeccionar el informe.
15
Atención: agregar unidades 
de la pendiente en la 
ecuación de la recta (según 
unidades del eje X)
Calcular la Vi como producto formado dividido el tiempo de reacción
(se puede expresar como cantidad/tiempo o como concentración/tiempo)
Lineamientos para el procesamiento de resultados del TP II
Controles
Tubos de 
reacción
Tubos con 
fosfato 
patrón
µmol/ml = mM
Como el volumen de reacción es 1 ml, coincide
numéricamente el valor de la cantidad de fosfato
expresada en µmoles con su concentración en mM
Calcular a partir de la ecuación de la curva de calibración el fosfato presente en cada tubo.
Según este valor y los resultados de los controles, calcular el producto  generado (se puede 
expresar como cantidad o como concentración de Pi)
Calcular a partir de la ecuación de la curva de calibración el fosfato presente en los tubos control 
(se puede expresar como cantidad o como concentración de Pi)
 Gráfico de Vi en función de [S] y 1/Vi en función de 1/¨[S]
 Estimación de Vmax y KM por ajuste no lineal  utilizando el Solver
 Cálculo de kcat
En la sección del campus correspondiente a la semana 3 encontrarán:
‐ la planilla para el ajuste no lineal
‐ las indicaciones para elaborar el informe (es muy importante que las lean y sigan)
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En base a los resultados del TP I, se definen las [E] y tiempo de reacción a utilizar en el TP II
Vi= ∆[P]/ ∆t
Tiempo reacción 
Se medirá el producto
formado a un único tiempo 
de reacción, para cada [S]
[Pi]t=x ‐ [Pi]t=o
 Estimar Vmax y KM
por ajuste no lineal
 Calcular kcat
([E] pasar a unidades de 
molaridad, PM= 160.000)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0 2 4 6 8 10 12
V
i (
m
M
/m
in
)
[S] (mM)
En el TP II se trabajará con una concentración de enzima fija, que dependiendo de los resultados del TP I
podría elegirse una sola, dos o cualquiera de las tres ensayadas en el primer TP. Según la concentración de
enzima que se elija, será el tiempo de reacción escogido (que debe estar comprendido en el intervalo de
linealidad para esa concentración de enzima).
Cada alumno realizará el TP II con una única concentración de enzima y en el informe entonces
confeccionarán una sola curva de Vi en función de la [S], a partir de la cual estimarán los parámetros
cinéticos.
La Vi se calculará como la concentración de producto (fosfato inorgánico) formado en el tiempo de
reacción correspondiente. Si hubiera fosfatos contaminantes en las soluciones (estarían presentes desde
el tiempo cero, antes del inicio de la reacción), deberían descontarse. Los controles que se incluyen en el
protocolo permiten estimar los fosfatos contaminantes.
A fines de repasar conceptos:
¿Cómo serían las curvas obtenidas para cada concentración de enzima si se graficaran en un mismo par de
ejes? ¿Cómo se modifica la Vi (y por lo tanto la Vmax) con la concentración de enzima? ¿Qué pasaría con los
valores de KM y kcat?
Los parámetros que son constantes para un mismo par enzima‐sustrato no deberían variar (obviamente,
siempre hay dispersión en los resultados debido al error experimental y podrían no dar idénticos).
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