FUNDAMENTOS Y APLICACIONES DE LAS PRINCIPALES TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN ENFERMEDADES MENDELIANAS

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FUNDAMENTOS Y APLICACIONES DE LAS PRINCIPALES
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN
ENFERMEDADES MENDELIANAS
 
La biología molecular aplicada al análisis del genoma humano ha revolucionado el
diagnóstico de las enfermedades genéticas en las últimas tres décadas, en particular las de
origen monogénico o mendeliano. El desarrollo y simplificación de las metodologías
moleculares para la identificación de variantes patogénicas han propiciado que cada vez sea
mayor el número de laboratorios que determinan el diagnóstico molecular como un proceso
habitual y a un costo cada vez menor. La caracterización del genotipo causante de una
enfermedad genética hace posible lo siguiente:
 
1. Establecer un diagnóstico certero en entidades cuyo diagnóstico clínico y de
laboratorio/gabinete es difícil, por ejemplo en la enfermedad de Alzheimer de inicio
temprano (MIM #607822), el síndrome de Rett de presentación atípica (MIM #312750) o
el extenso grupo de las ataxias espinocerebelosas.
2. Identificar de forma inequívoca a individuos portadores de trastornos autosómicos
recesivos, como la fibrosis quística (MIM #602421), o recesivos ligados al cromosoma
X, como la hemofilia A (MIM #306700).
3. Proporcionar diagnósticos prenatales a parejas con un riesgo elevado de recurrencia para
una enfermedad letal o limitante de la sobrevida, como la atrofia músculo-espinal de tipo
I (MIM #253300), el síndrome de Hunter (MIM #309900) o la distrofia muscular de
Duchenne (MIM #310200).
4. Establecer un diagnóstico presintomático en sujetos con un genotipo de riesgo que aún
no muestran manifestaciones clínicas y en quienes es posible instituir medidas
preventivas, por ejemplo en los síndromes de cáncer familiar, como la neoplasia
endocrina múltiple de tipo 2 (MIM #162300 y #171400), el carcinoma de mama y ovario
familiar (MIM #612555 y #604370) o el síndrome de Lynch (MIM #120435).
5. Correlacionar el genotipo identificado con la presentación clínica del paciente, por
ejemplo en la glucogenosis de tipo II o la enfermedad de Pompe (MIM #232300) en la
cual los afectados con un fenotipo atenuado o tardío de la enfermedad poseen en ~50% de
los casos un genotipo GAA heterocigoto compuesto para una variante intrónica
hipomórfica (c.-32-13T>G) y una variante patogénica grave. En otros padecimientos, el
genotipo identificado predice la reacción a los fármacos; por ejemplo, la respuesta a la
sapropterina o BH4, un cofactor enzimático que actúa también como molécula chaperona
de la enzima fenilalanina-hidroxilasa (PAH), se predice favorable en individuos con
fenilcetonuria (MIM #261600) con genotipo homocigoto c.1169A>G o p.(Glu390Gly);
en cambio, los pacientes homocigotos para la variante intrónica patogénica c.60+5G>T se
consideran absolutamente no respondedores.
6. Por último, el genotipo puede predecir o explicar en ocasiones el modo de herencia
esperado para una misma enfermedad; por ejemplo, las β-talasemias por mutaciones
amorfas ubicadas en el promotor o los primeros dos exones del gen HBB se heredan en
forma autosómica recesiva (MIM #613985), mientras que las debidas a mutaciones
antimorfas o con efecto dominante negativo ubicadas en el exón 3 lo hacen en forma
autosómica dominante (MIM #603902).
 
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Para la realización de las pruebas moleculares es necesaria la purificación de los ácidos
nucleicos a analizar. Por lo general, la molécula de elección es el DNA, ya que en ella se
pueden identificar variantes génicas o mutaciones causantes de una patología en la mayor
parte de los casos. Cualquier célula nucleada, como los leucocitos totales de sangre
periférica con anticoagulante EDTA o ACD, las células de descamación de la mucosa oral,
los tejidos embebidos en parafina, las gotas de sangre seca depositadas en papel filtro, los
amniocitos, las biopsias de vellosidades coriónicas o blastómeros, entre otras, es fuente de
DNA genómico para la práctica de los análisis moleculares.
Cuando es necesario analizar el efecto de una variante que altera el procesamiento del
RNA o la expresión del gen, la molécula de estudio es el transcrito maduro o mRNA, cuya
obtención requiere la disponibilidad de una muestra de tejido, de preferencia no fijado y
fresco, en el cual se exprese el gen a estudiar. En este tipo de análisis es recomendable que
la toma de muestra sea lo menos invasiva y riesgosa posible, además de evaluar la relación
costo-beneficio de la prueba molecular. Una vez purificado, el mRNA se convierte en DNA
complementario o cDNA por un procedimiento conocido como retrotranscripción. El
cDNA generado es idéntico a la secuencia codificante del gen (sin intrones) presente en el
mRNA maduro. Este cDNA es más estable que el RNA y puede analizarse mediante las
mismas técnicas que al DNA genómico.
 
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (polymerase chain reaction) implica la
amplificación de una secuencia especifica de DNA in vitro. Kary Mullis desarrolló la
técnica en 1983 y sus efectos en la investigación genética fueron inmediatos, dado que con
ella se amplifica de manera específica una secuencia de interés del genoma. La PCR es el
proceso inicial en la mayoría de las metodologías actuales y de uso sistemático en la
identificación de variantes génicas, entre ellas la secuenciación automatizada de tipo Sanger
y la amplificación múltiple dependiente de la ligación de sondas o MLPA, descritas más
adelante.
La PCR es sencilla y toma poco tiempo para su realización. En ella se utiliza una mezcla
de reacción que contiene una solución amortiguadora, un cofactor enzimático como el
cloruro de magnesio, una DNA polimerasa dependiente de DNA termoestable (Taq
polimerasa), una mezcla equimolar de los desoxinucleósidos trifosfato de adenina, guanina,
citosina y timina, así como dos moléculas de oligonucleótidos de cadena sencilla o
cebadores de 16 a 24 nucleótidos de longitud, los cuales delimitan el fragmento que se
desea amplificar puesto que contienen la secuencia complementaria de los extremos de la
región génica de interés. Para seleccionar los cebadores es necesario conocer la secuencia
del fragmento de DNA que se amplificará, situación que ya no es una limitante gracias a la
finalización del Proyecto del Genoma Humano y a la existencia de diversos programas de
cómputo disponibles en línea (GeneFisher: https://bibiserv.cebitec.uni-
bielefeld.de/genefisher2 o PrimerBLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)
con los cuales pueden diseñarse los cebadores idóneos.
La síntesis enzimática a cargo de la Taq DNA polimerasa, y dirigida por los cebadores de
las nuevas cadenas de DNA en la PCR, se lleva a cabo mediante una serie de cambios de
temperatura programados de forma automática en termociclador (figura 3-1). El ciclo de
temperaturas se repite unas 25 a 35 veces y, dado que en cada ciclo teóricamente se produce
el doble de la cantidad de copias del DNA que existían, al final de la reacción se obtienen
billones de moléculas de una región específica de DNA (235 = 3.4 x 1010 copias al final de la
PCR) y que es de interés para el diagnóstico molecular.
 
FIGURA
3-1
Etapas de la PCR. Cada ciclo está compuesto por tres temperaturas: de desnaturalización, alineación y
extensión. La temperatura de desnaturalización (94°C) permite que el DNA de doble cadena se separe en dos
cadenas sencillas de DNA. La temperatura de alineación favorece la unión de los cebadores a sus cadenas
complementarias, de tal modo que se forman así regiones de DNA de doble cadena con un extremo 3’ OH
libre. La temperatura de alineación es variable y está determinada por la secuencia de los cebadores. La
temperatura de extensión (72°C) hace posible la síntesis de las cadenas nuevas de DNA por una DNA
polimerasa termoestable, como la Taq DNA polimerasa obtenida del microorganismo termofílico Thermus
aquaticus, la cual tolera varios ciclos con temperaturas >90ºC sin perder ostensiblemente su actividad
catalítica.
 
 
A continuación se describen las metodologías utilizadas con mayor frecuenciaen el
diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias en las que se emplea la PCR como
primera etapa.
 
Secuenciación de tipo Sanger
La secuenciación de DNA es el método que permite conocer el orden preciso que guardan
los nucleótidos en una secuencia específica. Para la detección de variantes génicas
patológicas es importante identificar si hay cambios en el orden en que se presentan los
nucleótidos con respecto a una secuencia de referencia de esa región o gen específico, de tal
forma que pueda determinarse si esos cambios producen una alteración en la proteína o el
transcrito que explique la patología. Se han ideado diferentes métodos para obtener la
secuencia nucleotídica de una región genómica y existen en la actualidad metodologías con
capacidad de obtener secuencias de millones de nucleótidos en una sola reacción; no
obstante, la técnica desarrollada por Sanger en su versión automatizada se considera la
norma de referencia para definir un cambio en el DNA y por ende para el diagnóstico
preciso de múltiples trastornos mendelianos caracterizados por una heterogeneidad alélica
amplia en la que predominan las mutaciones puntuales o pequeñas inserciones/deleciones,
tal y como ocurre en los síndromes de cáncer de mama y ovario familiar (MIM #61255 y
#604370), el complejo de esclerosis tuberosa (MIM #191100 y #613254), la poliquistosis
renal del adulto (MIM #173900), la hipercolesterolemia familiar (MIM #143390), la
neurofibromatosis de tipo I (MIM #162200), las hemofilias de tipos A (MIM #306700) y B
(MIM #306900), los síndromes de Marfan (MIM #154700), Wiskott-Aldrich (MIM
#301000), CHARGE (MIM #214800), Fabry (MIM #301500) y Hunter (MIM #309900),
entre otros.
El método de secuenciación de tipo Sanger se basa en la interrupción de la síntesis de una
cadena nueva de DNA por la adición de las cuatro bases nitrogenadas (adenina, citosina,
guanina y timina, o A, C, G, T, respectivamente) en su versión de didesoxinucleótidos
(carentes del grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la desoxirribosa) a través del uso de una
cadena de DNA sencilla como molde correspondiente a la región de la cual se desea obtener
el orden preciso de los nucleótidos. En un principio, esta técnica era laboriosa, empleaba
isótopos radiactivos, su rendimiento y resolución se limitaban a secuencias cortas de DNA
y un número pequeño de muestras. En la actualidad, el proceso se ha automatizado gracias
al empleo de equipos conocidos como secuenciadores capilares y a la incorporación de
cuatro fluorocromos distintos en los didesoxinucleótidos para la identificación inequívoca
del orden que guardan las bases nitrogenadas en un fragmento de DNA. El principio de la
reacción de secuenciación automatizada de tipo Sanger se ilustra en la figura 3-2 y una
animación del proceso puede consultarse en línea en
http://dnalc.org/resources/animations/cycseq.html.
 
FIGURA
3-2
Secuenciación de DNA por el método de Sanger automatizado. A) Por lo general, el fragmento a secuenciar
es un producto de PCR hasta de 1 kb de la región de interés. Este producto de PCR se desnaturaliza y en la
presencia de un cebador comienza la síntesis de una nueva cadena de DNA por acción de una DNA
polimerasa. En la reacción de secuenciación se incluyen desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) de cada una de
las bases nitrogenadas (adenina, citosina, guanina y timina), así como una proporción menor de
didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) de cada una de las bases nitrogenadas, marcados con un fluoróforo
distinto. La adición aleatoria de un didesoxinucleótido en las cadenas en crecimiento interrumpe la síntesis,
dado que esta molécula no cuenta con el grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la pentosa, lo que hace
imposible la generación de un nuevo enlace fosfodiéster con otro dNTP o ddNTP. Lo anterior produce, en
cada reacción, la generación de varias cadenas nucleotídicas de diferentes longitudes, las cuales están
marcadas en su extremo 3’ con un ddNTP que porta sólo un fluorocromo distintivo para la última base de la
cadena. B) Las cadenas sintetizadas, dado que tienen diferentes tamaños, pueden separarse por electroforesis
capilar de alta resolución y detectarse con un equipo óptico que determina el fluoróforo presente al final de
cada una de las cadenas interrumpidas. Puesto que la cadena de tamaño más pequeño se desplaza con mayor
rapidez por el capilar, es la primera en detectarse y al reconocerse el fluoróforo presente al final de esta
cadena se puede establecer el nucleótido en el cual se interrumpió su síntesis; la siguiente cadena que pase
por el detector es aquella que tiene un tamaño en longitud mayor sólo por la presencia de un nucleótido más
y, de nueva cuenta, al determinar el fluoróforo presente al final se establece el nucleótido en el que fue
interrumpida y así sucesivamente; al establecer en cada cadena sintetizada el nucleótido en el cual fue
interrumpida su síntesis se puede obtener la secuencia de nucleótidos del fragmento original de DNA. Un
programa en una computadora acoplada al secuenciador registra el orden de las bases en un
electroferograma.