clase 11

Vista previa del material en texto

CATEDRA DE VIROLOGIA
AÑO LECTIVO
2021 – 2022
DOCENTE
DRA. CARMEN MOSQUERA DE CHOEZ
 MICROBIÓLOGO – BIOLOGA MOELECULAR
MSC EN BIOTECNOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS
ESCUELA DE MEDICINA
SEGUNDO AÑO
METODOS INDIRECTOS O SEROLOGICOS
Demostrar en el suero del paciente la presencia de anticuerpos específicos antivirales.
Mediante serología 
existen dos métodos:
Determinar la 
presencia de IgM 
especifica
Detectar la conversión 
serológica
Aparición de 
anticuerpos o el 
aumento de su titulo en 
mas de cuatro veces en 
dos muestras pareadas 
de suero 
2da: en la 
convalecencia a los 
14-21 días de la 
primera
SUERO DE 
CONVALECENCIA
1era muestra: 
obtenida durante el 
periodo agudo
SUERO AGUDO
Es un conjunto de técnicas que sirven 
para determinar la respuesta inmune 
de un paciente. (ag-ac)
La detección de la conversión serológica permite realizar diagnostico de infección reciente con toda certeza.
Cuando los títulos de anticuerpos en ambas muestras son bajos, o no se observa un aumento significativo(mas de 
cuatro veces en su titulo) no puede atribuirse la presencia de esos anticuerpos a la infección actual sino a una infección 
previa.
Ese paciente será inmune al virus en cuestión. Si no se observan anticuerpos en ninguna de las dos muestras el 
paciente es no inmune, es decir sensible a la infección.
La detección de IgM especifica permite realizar con 
certeza un diagnostico de infección reciente.
Duración: 1-2 meses
Enfermedades virales posnatales (rubeola, hepatitis A)
Infecciones congénitas (rubeola, citomegalovirus)
El recién nacido normal 
IgM: +5mg/ml
IgM → infección congénita
IgG → del recién nacido muestra la experiencia 
inmunológica de la madre
Ig M
Ig G
METODOS CLASICOS DE DIAGNOSTICO SEROLOGICO EN VIROLOGIA
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
AGLUTINACION
NEUTRALIZACION
La prueba está basada en aislamiento viral con el uso de 
cultivos/líneas celulares.
Trabaja con ac monoclonales, policlonales específicos para que 
capten el antígeno viral.
VENTAJAS DESVENTAJAS
De gran valor en estudios epidemiológicos. Es un proceso complejo
Determina la presencia de anticuerpos protectores 
inducidos mediante vacunas.
Su proceso suele abarcar hasta 4 semanas
Costosa
Pone en evidencia la capacidad 
neutralizante de los anticuerpos 
presentes en el suero del paciente sobre 
cepas virales patrón (prototipo). 
Cultivos: mayoría de los virus.
Inoculación en animales (ratones): 
Coxackie A, arbovirus y virus Junín.
Es la capacidad de los ac de quitar la parte toxica/infectiva.
Neutralización 
• Pone en evidencia la 
capacidad neutralizante de 
los anticuerpos presentes en 
el suero del paciente sobre 
cepas virales patrón 
(prototipo). 
Principio
• De gran valor en estudios 
epidemiológicos.
• Determina la presencia de 
anticuerpos protectores 
inducidos mediante vacunas.
Utilidad 
1 hora a 37º C 
Mayoría de los virus 
• Coxsackie A 
• Arbovirus 
• Virus Junin
Procedimiento y Resultados: 
Neutralización-Inconvenientes
Complejidad Requiere de: 
virus que puedan 
propagarse en 
cultivos celulares 
o animales 
Paneles de 
antisueros 
específicos 
Condiciones de 
bioseguridad 
Procedimiento y Resultados: 
• 1. Se toma la muestra de suero.
• 2. Los diferentes individuos presentan diferentes niveles de proteínas 
del complemento en su suero. Estas proteínas del complemento en el 
suero deben destruirse y reemplazarse por una cantidad conocida de 
proteínas del complemento estandarizadas.
• El suero se calienta de tal manera que todas las proteínas del complemento que contenga se 
destruyan, pero no los anticuerpos. 
• Se agrega al suero una cantidad conocida de proteínas del complemento estándar (estas 
proteínas se obtienen con frecuencia del suero de cobaya ).
• 3. El antígeno de interés se añade al suero.
• 4. Se agregan al suero glóbulos rojos de oveja (sRBC)​ que se han unido 
previamente a los anticuerpos anti-sRBC. La prueba se considera 
negativa si la solución se vuelve rosa en este punto y positiva en caso 
contrario.
Fijación del 
complemento 
• Se basa en la capacidad 
del complemento para 
unirse a los complejos 
Ag-Ac.
Principio 
• Permite detectar 
anticuerpos contra 
antígenos internos del 
virus.
Utilidad 
ENZIMOINMUNOENSAYO (E.L.I.S.A. INDIRECTA)
VENTAJAS DESVENTAJAS
Alta sensibilidad Protocolo mas complejo
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
1. Preparación
2. Disolución
3. 1era Incubación
4. Lavado
5. Enzima
6. Lavado
8. 2da Incubación
9 Solución de stop
10. Lectura de resultado
7. TMB Sustrato
PROCEDIMIENTO
37°C 1 hora
15 mins
TIPO FUENTE AG DETECTA
Kit de 1era 
Generación
Lisados virales Anti VIH-1 IgG
Kit de 2da 
Generación
Péptidos Recombinantes 
/Sintéticos de VIH-1 y VIH-2
IgG
Kit de 3era 
Generación
Péptidos Recombinantes 
/Sintéticos de VIH-1 y VIH-2 
y Antígeno VIH-1 del grupo 
“O”
IgG + IgM
Kit de 4ta 
Generación
Péptidos Recombinantes 
/Sintéticos de VIH-1 y VIH-2 
y Antígeno VIH-1 del grupo 
O y anticuerpos anti Ag p24
IgG+ IgM+ Ag p24
GENERACIONES DE LAS PRUEBAS
TIPO
FUENTE AG
DETECTA
Kit de 1era Generación
Lisados virales Anti VIH-1
IgG
Kit de 2da Generación
Péptidos Recombinantes /Sintéticos de VIH-1 y VIH-2
IgG
Kit de 3era Generación
Péptidos Recombinantes /Sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y 
Antígeno VIH-1 del grupo “O”
IgG + IgM
Kit de 4ta Generación
Péptidos Recombinantes /Sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y 
Antígeno VIH-1 del grupo O y anticuerpos anti Ag p24
IgG+ IgM+ Ag p24
1. Añadir 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo.
2. Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo las TIRAS DE 
NITROCELULOSA necesarias y coloque cada tira en su pocillo con el 
numero hacia arriba.
3. Incube las tiras durante 1 o 2 min a temperatura ambiente en un plato 
basculante. Extraer el tampón por aspiración.
4. Añada 2ml de TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo.
5. Añada 20 micro litros de suero de pacientes en cada uno de los pocillos.
6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a 
temperatura ambiente en el plato basculante.
8. Lave tres veces cada tira con 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO, 
dejando que se empapen durante 5min en la plataforma basculante.
7. Aspirar la mezcla de los pocillos. Evitar contaminaciones.
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO
11. Aspire el Conjugado de los pocillos y lavar tres veces.
13. Cubra la bandeja e incube durante 15min en la plataforma basculante.
14. Aspire el sustrato y lavar tres veces.
15, Utilizando pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel, 
cúbralas y séquelas con cuidado.
16. Coloque las tiras en una hoja de trabajo y Observe las 
bandas calificando los resultados.
12. Añadir 2ml de SUSTRATO a cada pocillo.
9 Añada 2ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo.
10. Cubrir la bandeja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en 
la plataforma basculante.
CRITERIOS
ATLANTA: Presentar 3 bandas de cada gen
3 ENVOLTURA → GP 120, 160, 41
3 CAPSIDE → P 24, 34, 17
TRANSCRIPTASA INVERSA → P 66, 51, 31
NORTEAMERICANA: Presenta 1
1 ENVOLTURA
1 CAPSIDE
PRESENTAR COMO MINIMO 2 BANDAS
PRINCIPIOS DE LA PRUEBA WESTERN BLOT
24
1. Separación de los Antígenos de lisado viral con sulfato de
sodio dodecil (SDS) y electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)
2. Transferencia (absorción) de los antígenos separados a
papel de nitrocelulosa
3. Prueba de la muestra del suero desconocido directamente
en la membrana absorbente utilizando una técnica similar a
la Elisa
25
1. Tiras de Nitrocelulosa
2. Control No Reactivo
3. Control Reactivo Fuerte
4. Control Reactivo Débil
5. Tampón de Blotting concentrado
6. Tampón de Lavado concentrado
7. Conjugado
8. Sustrato
9. Polvo de Blotting
26
1. Agua Destilada o desionizada
2. Guantes Desechables
3. Plataforma basculante
4. Pipetas de Pasteur
5. Aspirador con deposito de Hipoclorito de sodio
6. Hipoclorito sódico
27
1. Tampón Diluidode Lavado:
2. Tampón de Blotting de Trabajo
3. Solución de Conjugado de Trabajo
4. Solución de Sustrato
Diluir 1 volumen de TAMPÓN DE LAVADO CONCENTRADO con 19
volúmenes de agua de calidad de reactivo.
Diluir 1 volumen de TAMPÓN BLOTTING CONCENTRADO con 9
volúmenes de Agua de calidad de reactivo.
Añada 1g de POLVO DE BLOTTING por cada 20ml de TAMPÓN
BLOTTING diluido ya preparado.
Diluir el CONJUGADO en TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO en
proporción de 1:500, por ejemplo, 10 micro litros en 5ml de TAMPÓN
BLOTTING DE TRABAJO
1. Añadir 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo.
2. Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo las TIRAS DE
NITROCELULOSA necesarias y coloque cada tira en su pocillo con el
numero hacia arriba.
3. Incube las tiras durante 1 o 2 min a temperatura ambiente en un plato
basculante. Extraer el tampón por aspiración
4. Añada 2ml de TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo.
5. Añada 20 micro litros de suero de pacientes en cada uno de los pocillos.
6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a
temperatura ambiente en el plato basculante.
7. Aspirar la mezcla de los pocillos. Evitar contaminaciones.
8. Lave tres veces cada tira con 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO,
dejando que se empapen durante 5min en la plataforma basculante.
9. Añada 2ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada
pocillo.
10.Cubrir la bandeja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente
en la plataforma basculante.
11.Aspire el Conjugado de los pocillos y lavar como en el paso 8.
12.Añadir 2ml de SUSTRATO a cada pocillo .
13.Cubra la bandeja e incube durante 15min en la plataforma
basculante.
14.Aspire el sustrato y lavar como en el paso 8 y 11.
15.Utilizando pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel,
cúbralas y séquelas con cuidado.
16.Coloque las tiras en una hoja de trabajo y Observe las bandas
calificando los resultados.
30
31
32
33
34
VENTAJAS DESVENTAJAS
Eficacia en la detección de la 
proteína especifica
Es muy costoso realizarlo
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
VENTAJAS DESVENTAJAS
Permite diagnosticar en pocas horas Alto costo de microscopio de IF
Elevada sensibilidad 70% Dificultad para interpretarse 
La facilidad de su realización
El principio esta basado en una lamina 
portaobjeto con pocillos circunscritos en el 
cual se pone la muestra del paciente (ac no 
conjugado), se lava, se lo deja media hora, 
se coloca el conjugado (fluoresceína), se lava 
cuatro veces, y se lee los resultados.
1. Preparación: Muestra cortada por criostato en portaobjetos, fijada con acetona fría. 10min .
2. Incubación con antisueros específicos (37 °c a 30min) 
3. Lavado: elimina anticuerpos no fijados. Lavar
4. Agregado: Anticuerpo conjugado con fluoresceína (Igs)
5. Incubación por media hora más. Lavar. 
PROCEDIMIENTO
INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION
VENTAJAS DESVENTAJAS
La observación es visual
Requiere un equipo mínimo y es de fácil realización.
Anticuerpos IHA se producen como respuesta a la 
infección con virus que presentan hemaglutinina en su 
envoltura.
Los anticuerpos IHA son tipo específicos, aparecen 
tempranamente luego de la infección y persisten por 
varios años. 
Son de facil deteccion ya que no son necesarios cultivos 
celulares.
rubéola y de sarampíón.
También se utilizan para influenza, parainfluenza, 
parotiditis, adenovirus y algunos enterovirus.
PROCEDIMIENTO
1.Rotular las placas con el número de los sueros a probar y el antígeno a 
utilizar. Es recomendable usar una placa por antígeno. Los sueros son 
probados utilizando 4, 8 o 12 diluciones de los mismos contra el antígeno; 
dependiendo del laboratorio. 
2.Añadir 0,025 mL de BABS a cada pozuelo.
3.Añadir 0,025 mL del suero a titular en el primer pozuelo de cada hilera. 
4.Diluir los sueros con pipeta “multicanal”. 
5.Añadir a cada pozuelo 0,025 mL de la dilución de antígeno que contiene 
8 unidades hemaglutinantes. 
6.Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. 
7.Añadir 0,05 ml de glóbulos rojos diluidos en el pH óptimo para el virus. 
8.Agitar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
PROCEDIMIENTO
1. Se agrega el suero del paciente
2. Se mezcla con una cantidad conocida de virus
3. Luego de la incubación se añaden globulos rojos (de cobayo, pollo etc)
4. Se observa la IHA, la que se produce solamente si el suero del paciente 
tiene los anticuerpos específicos para el virus que se esta ensayando
INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA)
PARAMIXOVIRUS
Los anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación son producidos como respuesta a la 
infección con virus que presentan en su envoltura hemaglutinina.
U a otros antígenos presentes en la cápside.
ADENOVIRUS
TOGAVIRUSORTOMIXOVIRUS
Son tipo- específicos. I
Se demuestran tempranamente luego de la infección y 
persisten por varios años.
Son de fácil detección.
FIJACION DEL COMPLEMENTO
VENTAJAS DESVENTAJAS
Detección de anticuerpos Baja sensibilidad y corta duración en circulación de los 
anticuerpos. 
Detecta solamente anticuerpos dirigidos contra antígenos 
de grupo o familia.
Uso restringido al diagnostico de arbovirus. 
Se detectan anticuerpos dirigidos contra antígenos 
internos del virus (grupo-específicos).
Los anticuerpos se detectan luego de la infección.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
VENTAJAS DESVENTAJAS
Alto costo de los equipos y manipulación de sustancias 
radioactivas.
Fundamento idéntico al de ELISA, la diferencia es que el ac esta 
marcado con un isotopo radioactivo.
Diferentes tipos: de unión competitiva, de fase solida directa, 
de fase solida con ac de captura, etc.) extremadamente 
sensibles.
La lectura se realiza con un contador de radiación gamma.
AGLUTINACION
Principio: consiste en enfrentar 
partículas (de látex, gelatina o 
glóbulos rojos) que contiene el 
antígeno viral adsorbido con el 
suero del paciente. Si existe 
anticuerpos específicos para el 
antígeno se producirá una 
reacción de aglutinación visible 
a la observación.
Esta técnica se emplea para 
diagnostico serológico de las 
infecciones producidas por HIV, 
HTLV.
	Diapositiva 1
	Diapositiva 2
	Diapositiva 3
	Diapositiva 4
	Diapositiva 5
	Diapositiva 6
	Diapositiva 7: Neutralización 
	Diapositiva 8: Procedimiento y Resultados: 
	Diapositiva 9
	Diapositiva 10: Neutralización-Inconvenientes
	Diapositiva 11: Procedimiento y Resultados: 
	Diapositiva 12: Fijación del complemento 
	Diapositiva 13
	Diapositiva 14
	Diapositiva 15
	Diapositiva 16
	Diapositiva 17
	Diapositiva 18
	Diapositiva 19
	Diapositiva 20
	Diapositiva 21
	Diapositiva 22
	Diapositiva 23
	Diapositiva 24: PRINCIPIOS DE LA PRUEBA WESTERN BLOT
	Diapositiva 25: Componentes del Kit
	Diapositiva 26: Materiales Adicionales 
	Diapositiva 27: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
	Diapositiva 28: PROCEDIMIENTO
	Diapositiva 29: PROCEDIMIENTO
	Diapositiva 30: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
	Diapositiva 31: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
	Diapositiva 32: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
	Diapositiva 33: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
	Diapositiva 34: VENTAJAS Y DESVENTAJAS
	Diapositiva 35
	Diapositiva 36
	Diapositiva 37
	Diapositiva 38
	Diapositiva 39
	Diapositiva 40
	Diapositiva 41
	Diapositiva 42: INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA)
	Diapositiva 43
	Diapositiva 44
	Diapositiva 45